生物化学九章核酸代谢课件.ppt

1、第一节第一节 DNADNA的合成的合成一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制DNA双螺旋的两条链碱基顺序互补的性质是DNA自我复制的基本要点第九章第九章 核酸代谢核酸代谢复制部位：复制部位：真核生物：真核生物：细胞核细胞核原核生物：原核生物：细胞质的核质区细胞质的核质区 DNA DNA复制时，亲代复制时，亲代DNADNA的双螺旋先解旋并分开，的双螺旋先解旋并分开，然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，各形然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，各形成一条互补链。这样，从亲代的一个成一条互补链。这样，从亲代的一个DNADNA双螺旋分双螺旋分子复制成两个与亲代的碱基序列完全相同的子代子复制成两

2、个与亲代的碱基序列完全相同的子代DNADNA分子。每个子代分子。每个子代DNADNA分子中，有一条链来自亲分子中，有一条链来自亲代代DNADNA，另一条则是新形成的，这样的复制方式叫，另一条则是新形成的，这样的复制方式叫做做半保留复制半保留复制（semiconservative replication）。）。半保留复制半保留复制DNA半保留复制实验证据半保留复制实验证据1958年Meselson(梅塞尔森)和Stall(斯塔尔)用同位素（15N）和氯化铯密度梯度离心，首次证明了DNA的半保留复制。用用15NH4Cl唯一氮源培唯一氮源培养大肠杆菌，之后，用养大肠杆菌，之后，用14NH4Cl培养，

3、然后进培养，然后进行行CsCl2进行密度梯度进行密度梯度离心。由于离心。由于15NH4Cl密密度大于度大于14NH4Cl，因此，因此，形成不同区带，经过，形成不同区带，经过若干代培养后，两个若干代培养后，两个14NH4Cl区带增多。区带增多。复制的反应复制的反应n1d ATPn2d CTPn3d GTPn4d TTPDNA聚合酶聚合酶DNA模板模板DNA+（n1+n2+n3+n4)PPiPPiPPi随即被焦磷酸酶水解，从而推动聚合反应的进行。随即被焦磷酸酶水解，从而推动聚合反应的进行。二、聚合酶二、聚合酶I I1956年Kornberg科恩伯格提取出了DNA聚合酶I。此酶为单肽链蛋白质，它以脱

4、氧核苷三磷酸为活性单体物质来合成DNA链DNADNA聚合酶聚合酶I I在合成在合成DNADNA时需下列物质：时需下列物质：（1）所有四种脱氧核苷三磷酸-dATP、-dGTP、-dCTP、-dTTP(脱氧胸苷三磷酸)及Mg2+。（2）带有自由3-羟基末端的有一定长度的DNA链作为前体，DNA聚合酶I不能从头开始合成DNA。（3）DNA模板DNA合成时增链的方向是从53的方向进行，增链速度约为10个核苷酸/秒脱氧核苷三磷酸上的-磷酸亲核进攻DNA链的3-OH末端。DNA聚合酶I具有外切酶的功能(35或53)。三、三、DNADNA聚合酶聚合酶IIII和和IIIIII1970年从大肠杆菌中分离出了DN

5、A聚合酶II和III在生物体中，聚合酶III的功能是合成新的合成新的DNADNA链链；DNA聚合酶I的功能是除去除去RNARNA引链和修补裂口引链和修补裂口。DNA聚合酶II的功能尚不清楚。DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII是大肠杆菌是大肠杆菌DNADNA复制过程中真复制过程中真正的复制酶！正的复制酶！解链酶四、解链酶（helicase）作用：能断裂互补碱基间的氢键作用：能断裂互补碱基间的氢键,使使DNADNA双双链分离形成链分离形成“复制叉复制叉”。五、单链五、单链DNADNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA-binding protein,SSB)选择性地与单链选

6、择性地与单链DNADNA结合。结合。作用：稳定作用：稳定DNADNA单链模板单链模板,包括防止重新形成双包括防止重新形成双 链、双螺旋结构以及防止被核酸酶水解链、双螺旋结构以及防止被核酸酶水解。六、引物酶(Primase)实际上该酶是一种特殊的RNA聚合酶。作用作用:在在DNADNA复制开始时复制开始时,在在5 5 端端(5(5 3 3 方向）方向）合成一小段合成一小段RNARNA引物。引物。53 5RNA引物5RNA引物53七、七、DNADNA聚合连接酶聚合连接酶1967年，在几个实验室同时发现了一种DNA连接酶作用：催化一条链的5-磷酸末端与另一条链的3-OH末端之间形成磷酸二酯健。只能连

7、接处于nick（缺口）状态的双链DNA，不能连接游离的两条单链DNA八、八、DNADNA的复制的复制真核细胞的复制是从多个起点开始的，以双向方式复制可是任何一种DNA聚合酶只能进行53的复制（领头领头链链）。如何解决以53为模板进行复制的过程？复制的起始1、在拓扑异构酶、解链酶及单链DNA 结合蛋白的共同作用下，DNA解旋、解链，形成复制叉。2、依赖于单链模板，由引物酶催化按碱基配对规律合成一小段RNA引物(原核细胞引物长50-100个碱基，真核约10个碱基。）复制起始阶段的特点复制起始阶段的特点真核细胞：真核细胞：具有多个起始位点具有多个起始位点原核细胞：原核细胞：仅有一个复制起始位点，但往

8、往是双向仅有一个复制起始位点，但往往是双向复制（如复制（如E.Coli）复制过程的调控主要取决于复制启动的频率，复制过程的调控主要取决于复制启动的频率，而而DNADNA延长的速度大体上是恒定的。由于真核生物延长的速度大体上是恒定的。由于真核生物在多位点上启动复制，所以尽管其在多位点上启动复制，所以尽管其DNADNA比原核生物比原核生物DNADNA大得多，但复制的总速度反而比原核生物快。大得多，但复制的总速度反而比原核生物快。DNADNA的复制是由引发体识别并结合于复制原点的复制是由引发体识别并结合于复制原点而被启动的，其机理比较复杂，目前还不十分明了而被启动的，其机理比较复杂，目前还不十分明了

9、。链的延长n引物合成后，由引物合成后，由DNADNA聚合酶聚合酶催化，在引物催化，在引物 3 3-OH-OH末端逐一添加与模板链对应互补的脱氧末端逐一添加与模板链对应互补的脱氧核苷三磷酸。核苷三磷酸。随着复制叉的推进，两条新链的合成方向是不同的：随着复制叉的推进，两条新链的合成方向是不同的：领头链领头链:链的链的延长方向延长方向（5 5 3 3）与）与解链方向解链方向（复（复制叉移动方向）制叉移动方向）相同相同，为连续合成。为连续合成。3 冈 崎 片 段5 5 5 3 5 3 前 导 链随后链：随后链：另一条链延伸的方向与复制叉前进的方向另一条链延伸的方向与复制叉前进的方向相反，它显然不能被连

10、续合成，需要复制叉推相反，它显然不能被连续合成，需要复制叉推进了一定的长度，有了一段进了一定的长度，有了一段DNA单链后，才能单链后，才能以此为模板合成一个片段。因此这条新链的合以此为模板合成一个片段。因此这条新链的合成是不连续的，而且总晚于先导链，所以称为成是不连续的，而且总晚于先导链，所以称为随后链随后链。这种前导链连续合成，随后链断续合成的这种前导链连续合成，随后链断续合成的方式，称为方式，称为半不连续复制半不连续复制。随后链中合成的多个随后链中合成的多个DNA片段，称为片段，称为冈崎冈崎片 段片 段。冈 崎 片 段 的 长 度 原 核 细 胞 中 约。冈 崎 片 段 的 长 度 原 核

11、 细 胞 中 约10002000个核苷酸，真核细胞中约个核苷酸，真核细胞中约100200个核苷酸。个核苷酸。引物酶引物酶在复制原点附近合成一段在复制原点附近合成一段RNA引物；引物；DNA聚合酶聚合酶(原核细胞原核细胞)在引物的在引物的3末端逐个添加脱氧核苷酸。末端逐个添加脱氧核苷酸。随着复制叉的推进，亲代随着复制叉的推进，亲代DNA双螺双螺旋不断被解开，先导链也不断延伸。旋不断被解开，先导链也不断延伸。先导链的合成先导链的合成 随后链的合成随后链的合成引物的合成引物的合成：随后链的每个冈崎片段都需要合成：随后链的每个冈崎片段都需要合成 RNA引物。也是由引物。也是由引物酶催化引物酶催化。冈崎

12、片段的合成冈崎片段的合成：DNA聚合酶聚合酶(原核细胞原核细胞)在引物的在引物的3末端使末端使DNA链延伸，直至抵达其链延伸，直至抵达其下游的另一个冈崎片段的下游的另一个冈崎片段的RNA引物引物的的5端。端。随后链的合成随后链的合成冈崎片段的连结冈崎片段的连结：DNA聚合酶聚合酶一边以其一边以其DNA聚合活聚合活性在上游冈崎片段的性在上游冈崎片段的3-OH末端添加末端添加脱氧核苷酸，一面以其脱氧核苷酸，一面以其53核酸外核酸外切活性切除引物，直至将引物全部切切活性切除引物，直至将引物全部切除。除。DNA连接酶连接酶将最后的缺口补好。将最后的缺口补好。先导链和随后链中先导链和随后链中DNA的延伸

13、由同一个的延伸由同一个DNA聚聚合酶合酶全全 酶二聚体催化酶二聚体催化 随后链的模板回折成环，从而使冈崎片段的延伸随后链的模板回折成环，从而使冈崎片段的延伸方向与先导链的延伸方向一致，它们的方向与先导链的延伸方向一致，它们的3末端分别落末端分别落在在DNA聚合酶聚合酶全酶的双活性部位。因此，随着聚合全酶的双活性部位。因此，随着聚合酶的移动，两条链同时延伸。酶的移动，两条链同时延伸。复制的终止水解引物及填补空隙水解引物及填补空隙 冈崎片段合成后，由DNA聚合酶水解去除RNA引物，并填补留下的空隙(53)聚合。最后由DNA连接酶催化连接成完整的链，从而产生完整的双链DNA分子。九、九、DNADNA

14、的复修的复修修复步骤如下：修复步骤如下：（1）特异的内切酶与损伤部位结合，在损伤部位的5-端切断磷酸二酯键；（限制性内切酶降解陌生的DNA）（2）外切酶水解除去包括损伤部位在内的一小段DNA单链。（3）DNA聚合酶I催化以母体为模板进行修复53。（4）连接酶进行连接。差错率为差错率为10-9-10-101.新合成的子链与母链之间碱基配对严格性新合成的子链与母链之间碱基配对严格性2.使用引物使用引物RNA3.DNA聚合酶对底物专一性聚合酶对底物专一性4.DNA聚合酶的校对作用聚合酶的校对作用5.DNA修复机制修复机制 DNA分子的完整性对细胞至关重要，这一点分子的完整性对细胞至关重要，这一点是其

15、它生物分子无法比拟的。在生物的进化中，是其它生物分子无法比拟的。在生物的进化中，DNA复制中可因复制中可因DNA聚合酶催化作用引发出偶然聚合酶催化作用引发出偶然的错误。环境因素（如辐射、紫外光照射、化学诱的错误。环境因素（如辐射、紫外光照射、化学诱变物等）也可引起变物等）也可引起DNA序列上的错误，这些错误序列上的错误，这些错误若不能予以改正而保留下来，会直接影响机体的生若不能予以改正而保留下来，会直接影响机体的生理功能，以致影响到后代的正常生长和发育。但是理功能，以致影响到后代的正常生长和发育。但是，生物体内存在有效的修复（，生物体内存在有效的修复（repair）体系，保证）体系，保证了了D

16、NA复制的高度精确性。复制的高度精确性。1.DNA1.DNA损伤的原因损伤的原因v 外环境中的射线外环境中的射线：X-射线、紫外线等射线、紫外线等 高剂量的紫外辐射使高剂量的紫外辐射使DNA链上邻链上邻近的嘧啶核苷酸之间形成化学键，生近的嘧啶核苷酸之间形成化学键，生成二聚体；此外还有成二聚体；此外还有脱嘌呤作用和脱脱嘌呤作用和脱氨基作用氨基作用.2.修复修复 所有细胞对所有细胞对DNA的损伤都有一定的修复能力，的损伤都有一定的修复能力，以恢复正常的以恢复正常的DNA结构。结构。修复的方式：光修复、切除修复、重组修复、修复的方式：光修复、切除修复、重组修复、SOS修复修复(1)光修复光修复 由由

17、DNA光裂合酶（光裂合酶（photolyase）催化。该酶需要催化。该酶需要光光（400 700 nm）才能激活，它能切除嘧啶二聚体才能激活，它能切除嘧啶二聚体之间的连键之间的连键(C-C键键)，从而修复由紫外照射而造成的，从而修复由紫外照射而造成的损伤。损伤。(2)切除修复切除修复 该类修复是指在一系列酶的作用下，将该类修复是指在一系列酶的作用下，将DNA分分子中受损伤的部分切除，并以完整的那一条链为模板子中受损伤的部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出新的被切去的部分，然后使损伤的，合成出新的被切去的部分，然后使损伤的DNA恢恢复正常结构的过程。切除修复系统可对多种损伤起修复正常结构的

18、过程。切除修复系统可对多种损伤起修复作用。切除修复有核苷酸切除修复（复作用。切除修复有核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）和碱基切除修复（）和碱基切除修复（base excision repair,BER）两种。）两种。(2)切除修复切除修复 修复机制修复机制:其过程是：切其过程是：切补补切切缝缝 由专一性核酸内切酶催化，在离损伤处附近切断由专一性核酸内切酶催化，在离损伤处附近切断 由由DNA聚合酶在断口处进行聚合酶在断口处进行DNA合成合成 由由5核酸外切酶将损伤部位切掉核酸外切酶将损伤部位切掉 由连接酶将新合成的由连接酶将新合成的DNA链与原来的链

19、连接链与原来的链连接 知识窗知识窗 NER缺陷与癌症和遗传疾病缺陷与癌症和遗传疾病 核苷酸切除修复（核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）缺陷与癌症的发生有关，如着色性皮肤病是由于体内NER系统缺陷引起皮肤细胞对日光或紫外线特别敏感，其所形成的T-T二聚体就是因缺乏能切除T-T二聚体的特异性核酸内切酶所致，以致在后续的复制中造成遗传信息改变，最终出现皮肤癌。一些常染色体退行性疾病患者对太阳光极其敏感。还有的患者在婴儿时期皮肤明显地改变，如干燥、进行性的雀斑和角质化（一种皮肤肿瘤）并伴有眼损伤如角膜溃烂、晶体混浊和神经退行性症等，进而发展为致死的皮肤癌，其发病率是正常人得此症的200倍。科凯尼氏综合症（cockayne syndrome CS）也是一种遗传疾病，与NER基因缺损有关，因此，CS患者对紫外照射高度敏感，表现出与皮肤癌同样的发病率。2.修复修复(3)SOS修复修复 细胞在紧急状态下，能细胞在紧急状态下，能诱导产生缺乏校对功诱导产生缺乏校对功能的能的DNA聚合酶聚合酶，它能在，它能在DNA的损伤部位进行复的损伤部位进行复制，从而避免了死亡，但产生很高的变异率。制，从而避免了死亡，但产生很高的变异率。