生物制药第四章课件.ppt

1、基因工程诞生的意义：基因工程诞生的意义：基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因交流基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因交流;在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟了在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟了 新的领域、注入了新的方法新的领域、注入了新的方法;为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径，在农业、为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径，在农业、工业、医药等领域有巨大的应用前景工业、医药等领域有巨大的应用前景.1 1）限制性内切酶和限制性内切酶和DNADNA连接酶的发现连接酶的发现 1970年当时在Wisconsin大学的H.G

2、.Khorana实验室的一个小组，发现T4DNA连接酶具有更高的连接活性，有时甚至能催化完全分离的两段DNA分子进行末端的连接。1972年在旧金山H.W.Boyer实验室首先发现的EcoRI核酸内切限制酶具有特别重要的意义。Hind的发现打破了基因工程的禁锢，1967年在世界上有5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。2 2）载体的发现）载体的发现 因为多数重组DNA片段不具备自我复制的能力，需要一个运送重组DNA分子到细胞中去的车子载体（vector），载体是特定的能自我复制的DNA分子。3 3）逆转录酶的发现）逆转录酶的发现1970年，Baltimore和Temin等同时各自发现了逆转录酶,

3、打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。2 2 技术上的三大发明技术上的三大发明DNADNA分子切割与连接技术的建立构成现代基因工程的技术核心分子切割与连接技术的建立构成现代基因工程的技术核心!（1 1）在）在7070年代，将外源年代，将外源DNADNA分子导入大肠杆菌的转化现象获得成功，分子导入大肠杆菌的转化现象获得成功，19721972年斯坦福大学的年斯坦福大学的S.CohenS.Cohen等人报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞等人报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样也能够摄取质粒的同样也能够摄取质粒的DNA,DNA,从此，大肠杆菌便成了分子克隆的良好的从此，大肠杆菌便成了分子克隆的良好的

4、转化受体。不到四年，转化受体。不到四年，世界上第一家基因工程公司世界上第一家基因工程公司“GenetechGenetech”注册注册登记登记，意味着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。意味着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。(2)1972(2)1972年美国斯坦福大学的年美国斯坦福大学的BergBerg获得了获得了SV40SV40和和DNADNA重组的重组的DNADNA分子，分子，率先完成了世界上第一次成功的率先完成了世界上第一次成功的DNADNA体外重组实验，并因此与体外重组实验，并因此与W.W.Gilbert,F.SangerGilbert,F.Sanger分享了分享了19801

5、980年度的年度的诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖(3)1973(3)1973年美国斯坦福大学的年美国斯坦福大学的Cohen Cohen 等人，将大肠杆菌等人，将大肠杆菌R6-5R6-5质粒质粒DNADNA（含（含卡那霉素抗性基因）和大肠杆菌卡那霉素抗性基因）和大肠杆菌pSC101pSC101质粒质粒DNADNA（含四环素素抗性基因）（含四环素素抗性基因）重组后转化大肠杆菌，产生同时表现出两种抗性的细菌。重组后转化大肠杆菌，产生同时表现出两种抗性的细菌。(4)Cohen(4)Cohen与与BoyerBoyer等合作，将非洲爪蟾编码核糖体的基因同等合作，将非洲爪蟾编码核糖体的基因同pSC101pSC10

6、1质粒质粒构成重组构成重组DNADNA分子，并导入大肠杆菌，证实动物基因进入了细菌细胞，分子，并导入大肠杆菌，证实动物基因进入了细菌细胞，并在细菌细胞中增殖和转录产生相应的并在细菌细胞中增殖和转录产生相应的mRNAmRNA。(5)Berg P(5)Berg P、CohenCohen和和BoyerBoyer等人的工作在世界上最早实现了等人的工作在世界上最早实现了DNADNA体外重组，建立了体外重组，建立了第一个基因克隆系统（质粒第一个基因克隆系统（质粒大肠杆菌），导致了一个全新的生物技术学科和大肠杆菌），导致了一个全新的生物技术学科和产业产业基因工程的诞生。基因工程的诞生。3 3 基因工程技术的

7、建立基因工程技术的建立4 DNA4 DNA测序技术的建立进一步促进了基因测序技术的建立进一步促进了基因工程的发展工程的发展在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法，目前Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱

8、氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，利用限制性按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，利用限制性内切核

9、酸酶和连接酶的性质，对基因片段和载体质粒进行切割和内切核酸酶和连接酶的性质，对基因片段和载体质粒进行切割和连接，建成重组连接，建成重组DNADNA，再转移到受体细胞，目的基因在细胞中表，再转移到受体细胞，目的基因在细胞中表达获得新的遗传性状达获得新的遗传性状属名种名菌株类型发现的顺序属名种名菌株类型发现的顺序3553OHPPOH3553OPPO3553补平修平克隆载体克隆载体表达载体表达载体 获得目的基因，获得目的基因，构建重组质粒构建重组质粒 产物分离纯化产物分离纯化 构建基因工程菌或细胞构建基因工程菌或细胞 培养工程菌培养工程菌 半成品和成品鉴定及包装半成品和成品鉴定及包装 除菌过滤除菌过

10、滤 基因工程基因工程制药流程：制药流程：上游技术上游技术下游技术下游技术上游上游DNA重组设计重组设计下游的操作工艺和设备下游的操作工艺和设备原原则则简简化化（一）（一）PCRPCR的原理和应用的原理和应用 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCRpolymerase chain reaction,PCR）1 1原理原理 特点：在体外模拟细胞内进行的特点：在体外模拟细胞内进行的DNADNA复制过程复制过程（MullisMullis，19841984）第三节基因工程技术环节和常用技术（一）PCR的原理和应用（1）变性（denaturation）：

11、模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。（2）退火（annealing）：温度下降，变性DNA复姓，使寡核苷酸引物即与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对。1原理（3）延伸（extension）：在适宜条件下（包括DNA聚合酶和核苷酸单体），引物3 端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。（4）重复变性、退火和延伸三步操作：DNA片段呈2的指数增长，在12小时内重复2530次循环，扩增的DNA片段拷贝数可增加至106107倍。2.PCR技术的关键酶-DNA聚合酶（1）Klenow聚合酶（大肠杆菌DNA聚合酶片段）（2）Taq DNA聚合酶（水生栖热菌（Thermus aqua

12、ticus）中分离，1988年萨奇（R.K.SaiKi）（3）pfu DNA聚合酶（火球菌（Pyrococcus Furiosus）中分离）（4）Vent DNA聚合酶（Thermococcus litoralis）利用利用PCRPCR克隆目的基因克隆目的基因1、常规的PCR2、反向、反向PCR（inverse PCR,I-PCR）克隆基因组）克隆基因组DNA片段，片段，I-PCR是根据已知序列扩增其旁侧序列是根据已知序列扩增其旁侧序列的方法。所用的引物与正常的的方法。所用的引物与正常的PCR引物方向相反引物方向相反 3、反转录、反转录PCR(reverse transcription-PCR

13、,RT-PCR)合成合成cDNA RT-PCR是以是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下为模板，在逆转录酶作用下合成合成cDNA，再复制成双链，再复制成双链DNART-PCR反向反向-PCRPolyethylenimine-based non-viral gene delivery systems化学试剂介导非病毒载体聚次乙亚胺 非病毒载体腺相关病毒3 3 其中最被看好的是腺相关病毒其中最被看好的是腺相关病毒 病毒基因组很小，如2型腺相关病毒是由4681个核苷酸组成的单链DNA，AAV可感染分裂期及静止期细胞，当辅助病毒不存在时，AAV能整合到宿主细胞基因组的特定区域，无致病性，免疫原性弱，因此

14、，它无毒高效，是目前理想的基因治疗载体。Sanger双脱氧终止法双脱氧终止法*少一个少一个OH脱氧核甘酸脱氧核甘酸与与双脱氧核甘酸双脱氧核甘酸结构比较结构比较G G A T C C G G G A T T C C 模板C C T C C T AC C T A GC C T A G GC C T A G G CC C T A G G C C C C T A G G C C C C C T A G G C C C T C C T A G G C C C T A 在链延伸过程中，链终止剂会随机插入，从而导致链延伸的随机终止，形成长短不等的片段，这些片段共同特征是末端是带不同荧光的终止剂。测序反应：测

15、序反应：荧光检测探头荧光检测探头电泳，看谁跑得快1 各色荧光的终止剂，可以分别取代相应的dNTP2 测序反应中，终止剂随机插入导致链终止3 毛细管电泳（可分辨一个碱基差别），按大小分开，短片段跑得快，会首先被检测到，监测器会检测记录相应得荧光信号4 给出序列（五）目的产物的表达与生产（五）目的产物的表达与生产.Enzyme digestionIntroduce DNA into E.coliSelection on antibiotic-containing medium Screening by hybridization Streptomyces DNA DNA carrying targ

16、et genes基因组文库的构建基因组文库的构建1 总DNA提取2 随机酶切3 与载体连接4 转化大肠杆菌5 筛选转化子6 转移至96空板7 杂交确定阳性克隆A BC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12DFGHI1 1 重组人胰岛素重组人胰岛素HumulinHumulin关于胰岛素：胰岛素是由51个氨基酸组成的双链多肽激素，分子量为5734道尔顿，A链有21个氨基酸；B链有30个氨基酸。是人体降低血糖的唯一激素），重组胰岛素是第一个重组药物蛋白类药物，：（1982年美国批准第一个重组蛋白药物（重组人胰岛素Humulin）优泌林胰岛素的结构重组人胰岛素由人胰岛素基因在异源细胞中

17、表达出来，和人体分泌的胰岛素结构完全相同，发挥自然来源的胰岛素相同的功能（降低血糖的唯一激素）技术路线：胰岛素基因（人源，动物源）连接到大肠杆菌载体上，在大肠杆菌中表达出来多肽1 1 重组人胰岛素重组人胰岛素HumulinHumulin一般过程ES细胞-19821982年，英国的年，英国的自然自然杂志发表了一篇文章：有两个美国杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快

18、转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2 23 3倍，体积大倍，体积大一倍。一倍。2004年日本静冈县中小家畜实验场宣布，该实验场和北里大学合作，成功克隆出了体内含有水母基因的转基因猪。在用紫外线照射这头刚诞生的转基因克隆猪时，猪蹄等部位会发出荧光 研究负责人之一、俄勒冈保健科学大学灵长类动物研究中心的杰拉尔德沙滕介绍说，研究人员共对只猴子的卵母细胞进行了转基因处理，接着对挑选出的个转基因卵母细胞进行人工授精，然后把这个受精卵分别植入只代孕猴妈妈的子宫中，结果共有只猴妈妈怀孕。但其中有三只小猴不幸夭折，还有一只未获成功，只有“安迪”不仅产下后身体健康，而且转基因特征明显。首例转基因猴完成此项研究的美国俄勒冈保健科学大学提供的新闻公报称，这只名为“安迪”的转基因猴于年月日诞生。它目前健康活泼，与另外两只小猴生活在特制的“公寓”里。此次添加在“安迪”体内的是一种绿色荧光蛋白（）标志基因。美国豪斯耳研究所神经生物研究室主任林曦解释说，“如果动物体内含有这种蛋白，在受到特定波长的光照射时，就会出现特定的荧光”。你接受转基因食品或药物吗？第四章就到这里了第四章就到这里了！