生物制药第四章课件.ppt
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- 生物制药 第四 课件
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1、基因工程诞生的意义:基因工程诞生的意义:基因工程的诞生打破了物种的界限,实现了物种间的基因交流基因工程的诞生打破了物种的界限,实现了物种间的基因交流;在实验室里对生物直接进行改造,为生命科学的研究开辟了在实验室里对生物直接进行改造,为生命科学的研究开辟了 新的领域、注入了新的方法新的领域、注入了新的方法;为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径,在农业、为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径,在农业、工业、医药等领域有巨大的应用前景工业、医药等领域有巨大的应用前景.1 1)限制性内切酶和限制性内切酶和DNADNA连接酶的发现连接酶的发现 1970年当时在Wisconsin大学的H.G
2、.Khorana实验室的一个小组,发现T4DNA连接酶具有更高的连接活性,有时甚至能催化完全分离的两段DNA分子进行末端的连接。1972年在旧金山H.W.Boyer实验室首先发现的EcoRI核酸内切限制酶具有特别重要的意义。Hind的发现打破了基因工程的禁锢,1967年在世界上有5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。2 2)载体的发现)载体的发现 因为多数重组DNA片段不具备自我复制的能力,需要一个运送重组DNA分子到细胞中去的车子载体(vector),载体是特定的能自我复制的DNA分子。3 3)逆转录酶的发现)逆转录酶的发现1970年,Baltimore和Temin等同时各自发现了逆转录酶,
3、打破了中心法则,使真核基因的制备成为可能。2 2 技术上的三大发明技术上的三大发明DNADNA分子切割与连接技术的建立构成现代基因工程的技术核心分子切割与连接技术的建立构成现代基因工程的技术核心!(1 1)在)在7070年代,将外源年代,将外源DNADNA分子导入大肠杆菌的转化现象获得成功,分子导入大肠杆菌的转化现象获得成功,19721972年斯坦福大学的年斯坦福大学的S.CohenS.Cohen等人报道,经氯化钙处理的大肠杆菌细胞等人报道,经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样也能够摄取质粒的同样也能够摄取质粒的DNA,DNA,从此,大肠杆菌便成了分子克隆的良好的从此,大肠杆菌便成了分子克隆的良好的
4、转化受体。不到四年,转化受体。不到四年,世界上第一家基因工程公司世界上第一家基因工程公司“GenetechGenetech”注册注册登记登记,意味着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。意味着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。(2)1972(2)1972年美国斯坦福大学的年美国斯坦福大学的BergBerg获得了获得了SV40SV40和和DNADNA重组的重组的DNADNA分子,分子,率先完成了世界上第一次成功的率先完成了世界上第一次成功的DNADNA体外重组实验,并因此与体外重组实验,并因此与W.W.Gilbert,F.SangerGilbert,F.Sanger分享了分享了19801
5、980年度的年度的诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖(3)1973(3)1973年美国斯坦福大学的年美国斯坦福大学的Cohen Cohen 等人,将大肠杆菌等人,将大肠杆菌R6-5R6-5质粒质粒DNADNA(含(含卡那霉素抗性基因)和大肠杆菌卡那霉素抗性基因)和大肠杆菌pSC101pSC101质粒质粒DNADNA(含四环素素抗性基因)(含四环素素抗性基因)重组后转化大肠杆菌,产生同时表现出两种抗性的细菌。重组后转化大肠杆菌,产生同时表现出两种抗性的细菌。(4)Cohen(4)Cohen与与BoyerBoyer等合作,将非洲爪蟾编码核糖体的基因同等合作,将非洲爪蟾编码核糖体的基因同pSC101pSC10
6、1质粒质粒构成重组构成重组DNADNA分子,并导入大肠杆菌,证实动物基因进入了细菌细胞,分子,并导入大肠杆菌,证实动物基因进入了细菌细胞,并在细菌细胞中增殖和转录产生相应的并在细菌细胞中增殖和转录产生相应的mRNAmRNA。(5)Berg P(5)Berg P、CohenCohen和和BoyerBoyer等人的工作在世界上最早实现了等人的工作在世界上最早实现了DNADNA体外重组,建立了体外重组,建立了第一个基因克隆系统(质粒第一个基因克隆系统(质粒大肠杆菌),导致了一个全新的生物技术学科和大肠杆菌),导致了一个全新的生物技术学科和产业产业基因工程的诞生。基因工程的诞生。3 3 基因工程技术的
7、建立基因工程技术的建立4 DNA4 DNA测序技术的建立进一步促进了基因测序技术的建立进一步促进了基因工程的发展工程的发展在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法,目前Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得可见的DNA碱基序列。Sanger法测序的原理就是,每个反应含有所有四种脱
8、氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增,并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止,终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几个至千以上个,相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。按设计的蓝图,从供体中提取或人工合成目的基因,利用限制性按设计的蓝图,从供体中提取或人工合成目的基因,利用限制性内切核
9、酸酶和连接酶的性质,对基因片段和载体质粒进行切割和内切核酸酶和连接酶的性质,对基因片段和载体质粒进行切割和连接,建成重组连接,建成重组DNADNA,再转移到受体细胞,目的基因在细胞中表,再转移到受体细胞,目的基因在细胞中表达获得新的遗传性状达获得新的遗传性状属名种名菌株类型发现的顺序属名种名菌株类型发现的顺序3553OHPPOH3553OPPO3553补平修平克隆载体克隆载体表达载体表达载体 获得目的基因,获得目的基因,构建重组质粒构建重组质粒 产物分离纯化产物分离纯化 构建基因工程菌或细胞构建基因工程菌或细胞 培养工程菌培养工程菌 半成品和成品鉴定及包装半成品和成品鉴定及包装 除菌过滤除菌过
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