氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略课件.ppt

1、氨基酸代谢控制发酵机制氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略及育种策略徐庆阳中国氨基酸技术服务中心中国氨基酸技术服务中心目目 录录 Chapter1 代谢机制理论基础 Chapter2 L-谷氨酸 Chapter3 L-亮氨酸 Chapter4 L-缬氨酸 Chapter5 L-异亮氨酸Chapter1 代谢机制理论基础氨基酸发酵机制氨基酸发酵机制 在一般情况下，微生物细胞只合成本身需要的中间代谢产在一般情况下，微生物细胞只合成本身需要的中间代谢产物，严格防止氨基酸、核苷酸等中间物质的大量积累。当物，严格防止氨基酸、核苷酸等中间物质的大量积累。当氨基酸或核苷酸等物质进入细胞后，微生物细胞立即停止氨基

2、酸或核苷酸等物质进入细胞后，微生物细胞立即停止该物质的合成，一直到所供应的养料消耗到很低浓度，微该物质的合成，一直到所供应的养料消耗到很低浓度，微生物细胞才能重新开始进行该物质的合成。微生物细胞中生物细胞才能重新开始进行该物质的合成。微生物细胞中这种调节控制作用主要靠两个因素，即参与调节的有关酶这种调节控制作用主要靠两个因素，即参与调节的有关酶的活性和酶量的活性和酶量 代谢控制机制的研究已经证明，酶的生物合成受基因和代代谢控制机制的研究已经证明，酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制。谢物的双重控制。一方面，从一方面，从DNA的分子水平上阐明了酶生物合成的控制机的分子水平上阐明了酶生物合成的控制

3、机制，酶的合成像普通蛋白质的合成一样，受到结构基因的制，酶的合成像普通蛋白质的合成一样，受到结构基因的控制，由结构基因决定形成酶分子的一级结构；控制，由结构基因决定形成酶分子的一级结构；另一方面另一方面,酶的生物合成还受代谢物（酶反应的底物、产物酶的生物合成还受代谢物（酶反应的底物、产物及其类似物）的控制和调节。当有诱导物存在时，酶的生及其类似物）的控制和调节。当有诱导物存在时，酶的生成量可以几倍乃至几百倍的数量增加。相反，某些酶促反成量可以几倍乃至几百倍的数量增加。相反，某些酶促反应的产物，特别是终产物，又能产生阻遏作用，使酶的合应的产物，特别是终产物，又能产生阻遏作用，使酶的合成量大大减少

4、。成量大大减少。参与氨基酸生物合成的关键酶主要有参与氨基酸生物合成的关键酶主要有12种：种：磷酸果糖激磷酸果糖激酶；酶；柠檬酸合成酶；柠檬酸合成酶；N-乙酰谷氨酸激酶；乙酰谷氨酸激酶；鸟氨酸转鸟氨酸转氨基甲酰酶；氨基甲酰酶；天冬氨酸激酶；天冬氨酸激酶；高丝氨酸脱氢酶；高丝氨酸脱氢酶；苏苏氨酸脱水酶；氨酸脱水酶；-乙酰乳酸合成酶；乙酰乳酸合成酶；DAHP（2-酮酮-3-脱氧脱氧-D-阿拉伯糖型庚糖酸阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸）合成酶；磷酸）合成酶；分支酸变位酶；分支酸变位酶；11预苯酸脱水酶；预苯酸脱水酶；12预苯酸脱氢酶。预苯酸脱氢酶。一般情况下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支一般情况

5、下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支点酶（点酶（branching enzyme）可以成为关键酶，但关键酶并）可以成为关键酶，但关键酶并不都是分支点酶。关键酶的关键效果也只是在特定的氨基不都是分支点酶。关键酶的关键效果也只是在特定的氨基酸生物合成过程中成立，而在其他氨基酸的生物合成过程酸生物合成过程中成立，而在其他氨基酸的生物合成过程中则不成立。例如，中则不成立。例如，-乙酰乳酸合成酶在缬氨酸生物合成乙酰乳酸合成酶在缬氨酸生物合成途径中起主导性的关键酶作用，但在异亮氨酸的生物合成途径中起主导性的关键酶作用，但在异亮氨酸的生物合成中，起主导性关键作用的却是苏氨酸脱水酶。该酶位于中，起主导性

6、关键作用的却是苏氨酸脱水酶。该酶位于-乙酰乳酸合成酶的前一阶段，并且不是分支点酶。乙酰乳酸合成酶的前一阶段，并且不是分支点酶。反馈控制与优先合成反馈控制与优先合成氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制（反馈阻遏与氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制（反馈阻遏与反馈抑制）和在合成途径分支点处的优先合成反馈抑制）和在合成途径分支点处的优先合成如图所示的反馈控制，由催化合成途径最初反应如图所示的反馈控制，由催化合成途径最初反应AB的初的初始酶受终产物氨基酸始酶受终产物氨基酸E的反馈抑制和合成途径上各种酶受终的反馈抑制和合成途径上各种酶受终产物氨基酸产物氨基酸E的反馈阻遏组成。的反馈阻遏组成。优先合

7、成优先合成 底物底物A经分支合成途径生成两种终产物经分支合成途径生成两种终产物E和和G，由于，由于a酶的酶酶的酶活性远远大于活性远远大于b酶的酶活性，结果优先合成酶的酶活性，结果优先合成E。E合成达到合成达到一定浓度时，就会抑制一定浓度时，就会抑制a酶，使代谢转向合成酶，使代谢转向合成G。G合成达合成达到一定浓度时就会对到一定浓度时就会对c酶产生抑制作用酶产生抑制作用平衡合成（平衡合成（balanced synthesis）底物底物A经分支合成途径生成两种终产物经分支合成途径生成两种终产物E与与G，由于，由于a酶的酶酶的酶活性远远大于活性远远大于b酶，结果优先合成酶，结果优先合成E。E过量后就

8、会抑制过量后就会抑制a酶，酶，使代谢转向合成使代谢转向合成G。G过量后，就会拮抗或逆转过量后，就会拮抗或逆转E的反馈抑的反馈抑制作用，结果代谢流又转向合成制作用，结果代谢流又转向合成E，如此循环，如此循环 微生物体内代谢过程的各种生物化学反应，都是由各种酶来微生物体内代谢过程的各种生物化学反应，都是由各种酶来催化的。按各种酶在代谢调节中作用的不同，又可将酶分催化的。按各种酶在代谢调节中作用的不同，又可将酶分为以下三类为以下三类 调节酶调节酶（常称关键酶，与代谢调节关系密切）（常称关键酶，与代谢调节关系密切）变构酶：通过酶分子构象的变化来改变酶活性的一类酶变构酶：通过酶分子构象的变化来改变酶活性

9、的一类酶同功酶：具有同一种酶的底物专一性，但分子结构不同的一类酶同功酶：具有同一种酶的底物专一性，但分子结构不同的一类酶多功能酶：能够催化两种以上不同反应的一类酶多功能酶：能够催化两种以上不同反应的一类酶 静态酶静态酶 一般与代谢调节关系不大的一类酶一般与代谢调节关系不大的一类酶 潜在酶潜在酶 指酶原、非活性型或与抑制剂结合的酶指酶原、非活性型或与抑制剂结合的酶同功酶同功酶 酶酶I和酶和酶都是催化都是催化AB的同功酶。的同功酶。G过量时，酶过量时，酶停止活动，停止活动，C也不能经过也不能经过F到到G 与此同时，酶与此同时，酶I活力不受影响，活力不受影响，A可以顺利地到可以顺利地到E，从而使，从

10、而使G过量，过量，但并不干扰但并不干扰E的合成的合成反馈抑制与反馈阻遏的比较反馈抑制与反馈阻遏的比较项目项目类型类型反馈阻遏反馈阻遏反馈抑制反馈抑制控制对象控制对象酶的生物合成酶的生物合成酶的活性酶的活性控制量控制量终产物浓度终产物浓度终产物浓度终产物浓度控制的水平控制的水平DNAmRNA酶蛋白酶蛋白酶蛋白的构象变化酶蛋白的构象变化控制装置控制装置终产物与阻遏蛋白的亲和力终产物与阻遏蛋白的亲和力终产物与变构部位的亲和力终产物与变构部位的亲和力控制装置的控制装置的动作动作阻遏蛋白与操纵基因结合，阻遏蛋白与操纵基因结合，通过变构效应，酶的结构发生变化通过变构效应，酶的结构发生变化不能合成不能合成m

11、RNA形成的控制形成的控制开、关控制开、关控制控制酶活性大小控制酶活性大小反应反应迟缓、粗的控制迟缓、粗的控制迅速、精确的控制迅速、精确的控制代谢途径代谢途径无定向代谢途径和合成代谢途径分支点等无定向代谢途径和合成代谢途径分支点等无定向代谢途径和合成代谢途径分支无定向代谢途径和合成代谢途径分支点等点等细胞经济细胞经济高分子化合物高分子化合物(酶蛋白酶蛋白)低分子化合物低分子化合物(酶反应生成物酶反应生成物)协同反馈抑制或称多价反馈抑制协同反馈抑制或称多价反馈抑制 当一条代谢途径中有两个以上终产物时，任何一个终产物都不当一条代谢途径中有两个以上终产物时，任何一个终产物都不能单独抑制途径第一个共同

12、的酶促反应，但当两者同时过剩时，能单独抑制途径第一个共同的酶促反应，但当两者同时过剩时，它们协同抑制第一个酶反应它们协同抑制第一个酶反应合作反馈抑制（合作反馈抑制（Cooperative feedback inhibition）合作反馈抑制也可称为增效反馈抑制（合作反馈抑制也可称为增效反馈抑制（Synergistic feedback inhibition）。这种反馈抑制不同于协同反馈抑制，也不同于积）。这种反馈抑制不同于协同反馈抑制，也不同于积累反馈抑制累反馈抑制 当任何一个终产物单独过剩时，只部分地反馈抑制第一个酶的当任何一个终产物单独过剩时，只部分地反馈抑制第一个酶的活性，只有当活性，只

13、有当G、E两个终产物同时过剩存在时，才能引起强烈两个终产物同时过剩存在时，才能引起强烈抑制，其抑制程度大于各自单独存在的和抑制，其抑制程度大于各自单独存在的和积累反馈抑制（积累反馈抑制（Cumulative feedback inhibition）在积累反馈抑制中，每一个最终产物只单独地、部分地抑制共在积累反馈抑制中，每一个最终产物只单独地、部分地抑制共同步骤的第一个酶，并且各最终产物的抑制作用互不影响。所同步骤的第一个酶，并且各最终产物的抑制作用互不影响。所以几个最终产物同时存在时，它们的抑制作用是积累的以几个最终产物同时存在时，它们的抑制作用是积累的顺序反馈抑制顺序反馈抑制(Sequent

14、ial feedback inhibition)顺序反馈抑制的过程是：顺序反馈抑制的过程是：F积累，停止积累，停止DE反应，减少反应，减少F的进一的进一步合成，更多的步合成，更多的D转到转到G，再由，再由G合成合成I或或K；I积累，抑制积累，抑制GH的反应；的反应；K积累，抑制积累，抑制GJ的反应，结果造成的反应，结果造成G的积累，引起的积累，引起G对对AB的反馈抑制，使整个途径停止的反馈抑制，使整个途径停止假反馈抑制假反馈抑制(Pseudo-feedback inhibition)假反馈抑制是指结构类似物引起的反馈抑制假反馈抑制是指结构类似物引起的反馈抑制Chapter2 L-谷氨酸谷氨酸谷

15、氨酸的生物合成途径 生成谷氨酸的主要酶反应生成谷氨酸的主要酶反应 谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径 谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸的生物合成包括谷氨酸的生物合成包括生成谷氨酸的主要酶反应 谷氨酸脱氢酶（谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应）所催化的还原氨基化反应 转氨酶（转氨酶（AT）催化的转氨反应）催化的转氨反应谷氨酸脱氢酶（谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应）所催化的还原氨基化反应 转氨酶（转氨酶（AT）催化的转氨反应）催化的转氨反应 谷氨酸合成酶（谷氨酸合成酶（GS）催化的反应）催化的反应生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸合成酶（谷氨酸合成酶（

16、GS）催化的反应）催化的反应 由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径 C6H12O6+NH3+3/2O2 C5H9O4N+CO2+3H2O谷氨酸生物合成的理想途径 由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的总反应方程式为：物合成谷氨酸的总反应方程式为：C6H12O6+NH3+1.5O2 C5H9O4N+CO2+3H2O 由于由于1摩尔葡萄糖可以生成摩尔葡萄糖可以生成1摩尔的谷氨酸，因此理摩尔的谷氨酸，因此理论糖酸转化率为论糖酸转化率为81.7%。谷氨酸发酵的代谢途径 由葡萄糖生物合

17、成谷氨酸的代谢途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径葡萄糖首先经葡萄糖首先经EMP及及HMP两个途径生成丙酮酸。其中以两个途径生成丙酮酸。其中以EMP途径为主，生物途径为主，生物素充足时素充足时HMP所占比例是所占比例是38%，控制生物素亚适量，发酵产酸期，控制生物素亚适量，发酵产酸期，EMP所占所占的比例更大，的比例更大，HMP所占比例约为所占比例约为26%。生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一部分经另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸，催化固定反应生成草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固定反应的

18、酶有丙固定反应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。草酰乙酸与乙酰草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成酸脱氢酶的作用下生成-酮戊二酸，酮戊二酸，-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化

19、反应生成谷氨酸谷氨酸发酵的代谢途径l控制谷氨酸合成的重要措施控制谷氨酸合成的重要措施-酮戊二酸氧化能力微弱，即-酮戊二酸脱氢酶活力微弱谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征就是-酮戊二酸氧化能力微弱。丧失-酮戊二酸脱氢酶的重要性已经用要求生物素和不分泌谷氨酸的大肠杆菌得以证明。甚至发现不要求生物素的一株丧失-酮戊二酸脱氢酶的突变株，能分泌2.3g/L谷氨酸，而其亲株却什么也不分泌。谷氨酸产生菌的-酮戊二酸氧化力微弱。尤其在生物素缺乏条件下，三羧酸循环到达-酮戊二酸时，即受到阻挡。把糖代谢流阻止在-酮戊二酸的堰上，对导向谷氨酸形成具有重要意义。在铵离子存在下，-酮戊二酸因谷氨酸脱氢酶的催化作用，经还原

20、氨基化反应生成谷氨酸。谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸脱氢酶活性强细胞膜对谷氨酸的通透性高 谷氨酸的分泌可降低细胞内产物的浓度，消除了谷氨酸转化成其它代谢物的可能，减低了对谷氨酸脱氢酶的抑制，并使谷氨酸的生成途径畅通。由生物素亚适量可造成细胞膜对产物的高通透性。生物素改变细胞膜通透性的机制与影响细胞膜磷脂的含量及成分有关。还可通过添加表面活性剂、高级饱和脂肪酸，或青霉素等控制细胞膜对谷氨酸的通透性。通过选育温度敏感突变株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等突变株也可控制细胞膜对谷氨酸的通透性。CO2固定酶固定酶系活力强系活力强Citrate synthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力强酶活力

21、强乙醛酸循环弱乙醛酸循环弱异柠檬酸裂解酶异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱活力欠缺或微弱-酮戊二酸氧化酮戊二酸氧化能力缺失或微弱能力缺失或微弱l乙醛酸循环的作用乙醛酸循环的作用谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径乙醛酸循环途径可看作乙醛酸循环途径可看作三羧酸循环的支路和中三羧酸循环的支路和中间产物的补给间产物的补给途径途径在菌体生长期之后，进在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，为了入谷氨酸生成期，为了大量生成、积累谷氨酸大量生成、积累谷氨酸，最好没有异柠檬酸裂解最好没有异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭酶催化反应，封闭乙醛乙醛酸循环酸循环谷氨酸生物合成的调节机制 优先合成与反馈调节优先合成与反馈调节

22、糖代谢的调节糖代谢的调节 氮代谢的调节氮代谢的调节优先合成 黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制-酮戊二酸合成后由于-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸。反馈调节黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2-柠檬酸合成酶 3-异柠檬酸脱氢酶 4-酮戊二酸脱氢酶 5-谷氨酸脱氢酶l优先合成优先合成 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸l

23、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的调节磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的调节 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定反应的关键酶，固定反应的关键酶，受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏优先合成与反馈调节l柠檬酸合成酶的调节柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制l异柠檬酸脱氢酶的调节异柠檬酸脱氢酶的调节 细胞内细胞内-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当酮戊二酸的量

24、与异柠檬酸的量需维持平衡，当-酮戊二酸过量时对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合酮戊二酸过量时对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成成-酮戊二酸酮戊二酸优先合成与反馈调节l-酮戊二酸脱氢酶的调节酮戊二酸脱氢酶的调节 在谷氨酸产生菌中，在谷氨酸产生菌中，-酮戊二酸脱氢酶活性微弱酮戊二酸脱氢酶活性微弱l谷氨酸脱氢酶的调节谷氨酸脱氢酶的调节 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。制和阻遏自身的合

25、成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。-酮戊酮戊二酸合成后由于二酸合成后由于-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸活力很强，故优先合成谷氨酸优先合成与反馈调节糖代谢的调节 l能荷能荷细胞所处的能量状态用细胞所处的能量状态用ATP、ADP和和AMP之间的关系来表示，之间的关系来表示，称为能荷（称为能荷（energy charge）能荷值在能荷值在0和和1之间变动。已知大多数细胞的能荷处于之间变动。已知大多数细胞的能荷处于0.80到到0.95之间，处于一种动态平衡）之间，处于一种动态平衡）糖代谢的调节l能荷控制能荷控制能量生成代谢系的调节

26、能量生成代谢系的调节如图所示，当生物体内即能荷降低，就会激活某些催化糖类分解的酶或解除ATP对这些酶的抑制（如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等），并抑制糖元合成的酶（如糖元合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等），从而加速糖酵解、TCA循环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。当能荷高时，就会抑制糖元降解、糖酵解和 TCA循环的关键酶，如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶，并激活糖类合成的酶，如糖元合成酶和果糖-1,6-二磷酸酯酶，从而抑制糖的分解，加速糖元的合成。1-磷酸果糖激酶 2-果糖1,6-二磷酸酯酶 3-柠檬酸合成酶 4-异柠檬酸脱氢酶5

27、-反丁烯二酸酶 6-乙酰CoA羧化酶 7-糖原磷酸化酶 8-糖原合成酶糖代谢的调节l生物素对糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节生物素对糖代谢速率的影响生物素对糖代谢速率的影响 生物素对糖代谢速率的影响，主要是影响糖降解速率，而不是影响生物素对糖代谢速率的影响，主要是影响糖降解速率，而不是影响EMP与与HMP途径的比率。在生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽途径的比率。在生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳

28、酸的溢出速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出生物素对生物素对CO2固定反应的影响固定反应的影响 生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应，据报道，生物素固定反应，据报道，生物素大过量时（大过量时（100 g/L以上），以上），CO2固定反应可提高固定反应可提高30%糖代谢的调节l生物素对糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节生物素对乙醛酸循环的影响生物素对乙醛酸循环的影响 乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导醋酸所诱导 以葡萄糖为原料发酵生产谷氨酸时，

29、通过控制生物素亚适量，几以葡萄糖为原料发酵生产谷氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。原因是丙酮酸氧化能力下降，醋乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。原因是丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以为醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶就很少酸的生成速度慢，所以为醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶就很少 由于异柠檬酸裂解酶受琥珀酸阻遏，在生物素亚适量条件下，因由于异柠檬酸裂解酶受琥珀酸阻遏，在生物素亚适量条件下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸

30、阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动谷氨酸的方向高效率地移动氮代谢的调节控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不去转化成其它氨基酸和参与蛋白质的合成氨酸不去转化成其它氨基酸和参与蛋白质的合成在生物素亚适量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶活力，琥珀酸氧化力弱，在生物素亚适量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶活力，琥珀酸氧化力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时又由于完全氧化降低的结果，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时又由于完全氧化降低的结果，使使ATP形成量

31、减少，导致蛋白质合成活动停滞，在铵离子适量存在下，形成量减少，导致蛋白质合成活动停滞，在铵离子适量存在下，使得菌体生成积累谷氨酸使得菌体生成积累谷氨酸生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白质生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白质在生物素充足条件下，异柠檬酸裂解酶活力增强，琥珀酸氧化力增强，在生物素充足条件下，异柠檬酸裂解酶活力增强，琥珀酸氧化力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酸乙酸、苹果酸脱羧丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酸乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，

32、合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其它氨基酸量增加用生成的其它氨基酸量增加谷氨酸细胞膜渗透性的控制 细胞膜的结构细胞膜的结构 控制细胞膜渗透性的方法控制细胞膜渗透性的方法细胞膜的脂质主要是磷脂，每一个磷脂分子由一个带正电荷且能细胞膜的脂质主要是磷脂，每一个磷脂分子由一个带正电荷且能溶于水的极性头和一个不带电荷、不溶于水的非极性尾所构成溶于水的极性头和一个不带电荷、不溶于水的非极性尾所构成,极极性头朝向膜的内外两个表面，呈亲水性；而非极性的疏水尾则埋性头朝向膜的内外两个表面，呈亲水性；而非极性的疏水尾则埋藏在膜的内层，从而形成一个磷脂双分子层。膜内的蛋白质有的藏在膜的内层，从而形成一个磷脂双分子层。

33、膜内的蛋白质有的是酶，有的是携带胞外物质进入细胞的载体蛋白，镶嵌或埋在脂是酶，有的是携带胞外物质进入细胞的载体蛋白，镶嵌或埋在脂质双层内或附着在它的表面，主要分为嵌入蛋白和表在蛋白。有质双层内或附着在它的表面，主要分为嵌入蛋白和表在蛋白。有的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖链主要朝向外表面。的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖链主要朝向外表面。细胞膜是一个选择性半渗透性膜，它的重要生理功能是控制细胞细胞膜是一个选择性半渗透性膜，它的重要生理功能是控制细胞内外物质的运送和交换，是细胞同外界环境进行物质交换和信息内外物质的运送和交换，是细胞同外界环境进行物质交换和信息交流的接触面。通过改变细胞膜的组成成分可改变膜的

34、渗透性。交流的接触面。通过改变细胞膜的组成成分可改变膜的渗透性。控制细胞膜渗透性的方法l控制磷脂的合成控制磷脂的合成生物素缺陷型生物素缺陷型 使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成 作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少

35、到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中漏出，积累于发酵液中控制细胞膜渗透性的方法l控制磷脂的合成控制磷脂的合成添加表面活性剂添加表面活性剂 使用生物素过量的原料（如糖蜜等）发酵生产谷氨酸时，通过添使用生物素过量的原料（如糖蜜等）发酵生产谷氨酸时，通过添加表面活性剂（如吐温加表面活性剂（如吐温60）或是高级饱和脂肪酸（）或是高级饱和脂肪酸（C1618）及其亲）及其亲水聚醇酯类，同样能清除渗透障碍物，大量积累谷氨酸水聚醇酯类，同样能清除渗透障碍物，大量积累谷氨酸 作用机制：表面活性剂、高级饱和脂肪酸的作用，并不在于

36、它的作用机制：表面活性剂、高级饱和脂肪酸的作用，并不在于它的表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成过程中，作为生物素的拮抗表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成过程中，作为生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通过拮抗脂肪酸的生物合成，导致物具有抑制脂肪酸的合成作用。通过拮抗脂肪酸的生物合成，导致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜，提高了细胞膜对谷氨磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜，提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性酸的渗透性控制细胞膜渗透性的方法l控制磷脂的合成控制磷脂的合成油酸缺陷型油酸缺陷型 使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酸培养基中油使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制

37、发酸培养基中油酸的浓度而控制磷脂的合成。酸的浓度而控制磷脂的合成。作用机制：由于油酸缺陷突变株阻断了油酸的后期合成，丧失了作用机制：由于油酸缺陷突变株阻断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力；即丧失脂肪酸生物合成能力，必须由外界供自身合成油酸的能力；即丧失脂肪酸生物合成能力，必须由外界供给油酸，才能生长。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的给油酸，才能生长。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性；通过控制油酸亚适量，使磷脂合成量减少多少和细胞膜的渗透性；通过控制油酸亚适量，使磷脂合成量减少到正常量的到正常量的1/2左右时，细胞变形，谷氨酸分泌于细胞外左右时，细胞

38、变形，谷氨酸分泌于细胞外控制细胞膜渗透性的方法l控制磷脂的合成控制磷脂的合成甘油缺陷型甘油缺陷型 使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中甘使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中甘油的浓度而控制磷脂的合成油的浓度而控制磷脂的合成 作用机制：甘油缺陷突变株的遗传阻碍是丧失作用机制：甘油缺陷突变株的遗传阻碍是丧失-磷酸甘油脱氢酶，磷酸甘油脱氢酶，所以自身不能合成所以自身不能合成-磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接

39、关系的磷脂含量，从而使谷氨酸得以积累的磷脂含量，从而使谷氨酸得以积累控制细胞膜渗透性的方法l控制磷脂的合成控制磷脂的合成温度敏感突变株温度敏感突变株 温度敏感突变株是通过诱变得到的在低温下生长，而在高温下却温度敏感突变株是通过诱变得到的在低温下生长，而在高温下却不能生长繁殖的突变株。利用温度敏感突变株进行谷氨酸发酵时，不能生长繁殖的突变株。利用温度敏感突变株进行谷氨酸发酵时，由于仅控制温度就能实现谷氨酸生产，所以又把这种新工艺称为物由于仅控制温度就能实现谷氨酸生产，所以又把这种新工艺称为物理控制方法。理控制方法。作用机制：温度敏感突变株的突变位置是发生在决定与谷氨酸分作用机制：温度敏感突变株的

40、突变位置是发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因上，发生碱基的转换或颠换，这泌有密切关系的细胞膜的结构基因上，发生碱基的转换或颠换，这样为基因所指导译出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的样为基因所指导译出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变改变控制细胞壁的合成 通过控制细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进而导致形成不完全通过控制细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进而导致形成不完全的细胞膜，间接控制细胞膜通透性。这可以通过在发酵对数生长期的的细胞膜，间接控制细胞膜通透性。这可以通过在发酵对数生长期的早期，添加青霉素或头孢霉素早期，添加青霉素或头孢霉素C等抗生素来实现。等

41、抗生素来实现。作用机制：添加青霉素是抑制谷氨酸产生菌细胞壁的后期合成，主要作用机制：添加青霉素是抑制谷氨酸产生菌细胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽转肽酶，影响细胞壁糖肽的生物合成是抑制糖肽转肽酶，影响细胞壁糖肽的生物合成日常菌种工作定期分纯定期分纯 一般一般12个月分纯个月分纯次，把产酸高、生长快、无噬菌体感染的菌株挑次，把产酸高、生长快、无噬菌体感染的菌株挑选出来选出来小剂量诱变刺激小剂量诱变刺激 用紫外线用紫外线(1020s)、通电、激光等轻微处理，可以淘汰生长微弱的菌、通电、激光等轻微处理，可以淘汰生长微弱的菌株，并能激发溶原性噬菌体，使挑选出来的菌是产酸高、生长旺盛、株，并能激发溶原性噬

42、菌体，使挑选出来的菌是产酸高、生长旺盛、无噬菌体感染的优良菌株无噬菌体感染的优良菌株高产菌制做安瓿管高产菌制做安瓿管 通过诱变育种或分纯挑出来的高产菌株，要马上做安瓿管，防止菌种通过诱变育种或分纯挑出来的高产菌株，要马上做安瓿管，防止菌种变异变异谷氨酸发酵的代谢控制育种策略（进通节堵出）选育耐高渗透压菌种选育耐高渗透压菌种 选育不分解利用谷氨酸的突变株选育不分解利用谷氨酸的突变株 选育细胞膜渗透性好的突变株选育细胞膜渗透性好的突变株 选育强化选育强化CO2固定反应的突变株固定反应的突变株 选育减弱乙醛酸循环的突变株选育减弱乙醛酸循环的突变株 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到选育强化三羧酸循环中从

43、柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株酮戊二酸代谢的突变株 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 选育强化能量代谢的突变株选育强化能量代谢的突变株 选育减弱选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株途径后段酶活性的突变株选育耐高渗透压菌种耐高糖突变株耐高糖突变株 选育在含选育在含2030葡萄糖的平板上生长好的突变株葡萄糖的平板上生长好的突变株耐高谷氨酸突变株耐高谷氨酸突变株 选育在含选育在含1520味精的平板上生长好的突变株味精的平板上生长好的突变株耐高糖、高谷氨酸突变株耐高糖、高谷氨酸突变株 选育在含选育在含20葡萄糖和葡萄糖和15味精的平板上生长好的突

44、变株味精的平板上生长好的突变株选育不分解利用谷氨酸的突变株 谷氨酸发酵，目的是积累谷氨酸谷氨酸发酵，目的是积累谷氨酸 如果菌种一边合成谷氨酸，一边分解利用谷氨酸，就达不到积累如果菌种一边合成谷氨酸，一边分解利用谷氨酸，就达不到积累谷氨酸的目的谷氨酸的目的 所以必须使菌种不能分解利用谷氨酸，切断所以必须使菌种不能分解利用谷氨酸，切断-酮戊二酸继续向下酮戊二酸继续向下氧化的反应，即选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的氧化的反应，即选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株突变株选育细胞膜渗透性好的突变株 谷氨酸产生菌细胞膜渗透性的改变是发酵法生产谷氨酸的关键谷氨酸产生菌细胞膜渗透性的改

45、变是发酵法生产谷氨酸的关键抗抗Vp类衍生物类衍生物 据有关资料报道，抗据有关资料报道，抗Vp类衍生物如香豆素、芦丁等能遗传性地改类衍生物如香豆素、芦丁等能遗传性地改变细胞膜的渗透性变细胞膜的渗透性选育溶菌酶敏感性突变株选育溶菌酶敏感性突变株选育二氨基庚二酸缺陷突变株选育二氨基庚二酸缺陷突变株选育温度敏感突变株选育温度敏感突变株选育强化CO2固定反应的突变株 选育以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长快、大的菌株选育以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长快、大的菌株 以琥珀酸为唯一碳源，菌体要想生长，碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反以琥珀酸为唯一碳源，菌体要想生长，碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应。菌休生长越

46、快，四碳二羧酸的脱羧反应越强，而四碳二羧酸的脱羧应。菌休生长越快，四碳二羧酸的脱羧反应越强，而四碳二羧酸的脱羧反应与二氧化碳固定反应是相同酶所催化的，所以以琥珀酸为唯一碳源，反应与二氧化碳固定反应是相同酶所催化的，所以以琥珀酸为唯一碳源，菌体长得越好，二氧化碳固定反应越强菌体长得越好，二氧化碳固定反应越强 选育氟丙酮酸敏感性突变株选育氟丙酮酸敏感性突变株 氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，菌种对氟丙酮酸越敏感，说明菌种丙氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，菌种对氟丙酮酸越敏感，说明菌种丙酮酸向乙酰酮酸向乙酰CoA的转化反应越弱，相对地的转化反应越弱，相对地CO2固定反应比例也就越大固定反应比例也就越

47、大 选育丙酮酸缺陷、天冬氨酸缺陷突变株选育丙酮酸缺陷、天冬氨酸缺陷突变株 克隆丙酮酸羧化酶基因克隆丙酮酸羧化酶基因选育减弱乙醛酸循环的突变株选育琥珀酸敏感型突变株选育琥珀酸敏感型突变株 琥珀酸是乙醛酸循环关键酶异柠檬酸裂解酶的阻遏物，菌种对琥珀酸是乙醛酸循环关键酶异柠檬酸裂解酶的阻遏物，菌种对琥珀酸越敏感，异柠檬酸裂解酶的合成能力越弱，乙醛酸循环琥珀酸越敏感，异柠檬酸裂解酶的合成能力越弱，乙醛酸循环就越弱就越弱 选育不利用乙酸的突变株选育不利用乙酸的突变株利用基因工程技术，使异柠檬酸裂解酶活力降低利用基因工程技术，使异柠檬酸裂解酶活力降低选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株选育

48、柠檬酸合成酶强的突变株选育柠檬酸合成酶强的突变株 柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，强化该酶能加柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，强化该酶能加强谷氨酸的生物合成强谷氨酸的生物合成 选育抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸和氟柠檬选育抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸和氟柠檬酸等突变株酸等突变株 抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸和氟柠檬酸都是乌头酸抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸和氟柠檬酸都是乌头酸酶的抑制剂，抗这些物质的突变株，可强化乌头酸酶酶的抑制剂，抗这些物质的突变株，可强化乌头酸酶的活力的活力 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育耐高谷氨酸的突变株选育耐高谷氨酸的突变株选育谷氨酸结构类似物抗性突变株，如谷

49、氨酸选育谷氨酸结构类似物抗性突变株，如谷氨酸氧肟酸盐抗性突变株氧肟酸盐抗性突变株选育谷氨酰胺抗性突变株选育谷氨酰胺抗性突变株选育强化能量代谢的突变株 谷氨酸高产菌的两个显著持点：谷氨酸高产菌的两个显著持点：-酮戊二酸继续向下氧化酮戊二酸继续向下氧化的能力缺陷和乙醛酸循环弱，使能量代谢受阻；的能力缺陷和乙醛酸循环弱，使能量代谢受阻；TCA循环循环前一阶段的代谢减慢。强化能量代谢，可补救上述两点不前一阶段的代谢减慢。强化能量代谢，可补救上述两点不足，使足，使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成的速度加快循环前一段代谢加强，谷氨酸合成的速度加快 选育呼吸抑制剂抗性突变株选育呼吸抑制剂抗性突变株 可选

50、育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株可选育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株 选育选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株磷酸化抑制剂抗性突变株 可选育可选育2,4-二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株 选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株 选育减弱选育减弱HMP途径后段酶活性的途径后段酶活性的突变株突变株选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长的突变株进生长的突变株选育抗嘌呤、嘧啶类似物的突变株选育抗嘌