每个杂交瘤细胞课件.ppt

1、 生物法（病毒诱导融合）生物法（病毒诱导融合）诱导方法：诱导方法：化学法（聚乙二醇诱导融合）化学法（聚乙二醇诱导融合）物理法物理法(电场诱导融合电场诱导融合)温故知新温故知新1.1.什么是细胞融合？什么是细胞融合？2.2.诱导细胞融合的方法有哪一些？诱导细胞融合的方法有哪一些？3.3.植物体细胞杂交技术是细胞融合的应用之一，他的原植物体细胞杂交技术是细胞融合的应用之一，他的原理是什么理是什么？有什么优势？有什么优势？优势：优势：克服了远缘杂交不亲和的障碍，克服了远缘杂交不亲和的障碍，创造新物种创造新物种，定向，定向改造生物性状。改造生物性状。原理：原理：细胞的全能性、细胞膜的流动性细胞的全能性

2、、细胞膜的流动性采用自然或人工的方法使采用自然或人工的方法使两个或多个两个或多个不同细胞不同细胞融合成一个细胞。融合成一个细胞。1 1、定义：、定义：在一定的条件下法使两个或多个不同的动物细在一定的条件下法使两个或多个不同的动物细胞融合成陈一个细胞的过程。胞融合成陈一个细胞的过程。三三.动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体（一）动物细胞融合（一）动物细胞融合 两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用2.诱导融合的方法诱导融合的方法 生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒诱导融诱导融合合.(.(利用灭活仙台病毒是动物细利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。胞融合所特有的。这

3、是由于病毒这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。功能。)化学法：化学法：聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG诱导融诱导融合合.物理法：物理法：电刺激电刺激融合融合病毒颗粒黏病毒颗粒黏 附细胞表面附细胞表面细胞膜连接细胞膜连接细胞膜被细胞膜被 病毒颗粒穿通病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂种细胞 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭质分子重新排布，细

4、胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。从从血血清清中中分分离离抗抗体体缺点：缺点：产量低、纯度低，且抗体的产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。特异性差、灵敏度低。多多种种效效应应B细细胞胞动动物物体体内内多多种种抗抗体体抗抗原原 1.1.传统获得抗体的方法传统获得抗体的方法（二）动物细胞融合的应用（二）动物细胞融合的应用单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备3.3.一个大胆的猜想一个大胆的猜想 将能够产生特定抗体的将能够产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增殖能和具有无限增殖能力的力的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合在一起，

5、形成杂交瘤细胞。杂交融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。2.2.一个美丽的发现一个美丽的发现在动物免疫反应的过程中，体内的在动物免疫反应的过程中，体内的B B细胞可以产生多达细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一种百万种以上的特异性抗体，但是每一种B B细胞只产生一细胞只产生一种抗体，想要获得大量的单一的抗体，必须对单个种抗体，想要获得大量

6、的单一的抗体，必须对单个B B细细胞进行无性，即克隆。胞进行无性，即克隆。米尔斯坦米尔斯坦(阿根廷阿根廷)和科勒和科勒(德国德国)因此在因此在19841984年获诺贝尔奖。年获诺贝尔奖。4.4.单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备提取提取用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基单抗单抗的制的制备过备过程要程要点：点：4.4.单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备注射抗原注射抗原B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合融合多种杂多种杂交细胞交细胞选择性培养基选择性培养基 筛选筛选1 1专一抗专一抗体检测体检测克隆化克隆化单克隆单克隆抗体抗体有限稀释法培养有限稀释法培养 筛选筛选2 21.注射抗原的目

7、的注射抗原的目的是什么？是什么？注射抗原注射抗原B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合融合多种杂多种杂交细胞交细胞选择性培养基选择性培养基 筛选筛选1 1专一抗专一抗体检测体检测克隆化克隆化单克隆单克隆抗体抗体有限稀释法培养有限稀释法培养 筛选筛选2 22.诱导细胞融合的诱导细胞融合的手段有哪些？手段有哪些？注射抗原注射抗原B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合融合多种杂多种杂交细胞交细胞选择性培养基选择性培养基 筛选筛选1 1专一抗专一抗体检测体检测克隆化克隆化单克隆单克隆抗体抗体有限稀释法培养有限稀释法培养 筛选筛选2 23.若细胞两两融合后，若细胞两两融合后，有几种融合情

8、况？有几种融合情况？注射抗原注射抗原B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合融合多种杂多种杂交细胞交细胞选择性培养基选择性培养基 筛选筛选1 1专一抗专一抗体检测体检测克隆化克隆化单克隆单克隆抗体抗体有限稀释法培养有限稀释法培养 筛选筛选2 24.第一次筛选出的杂交瘤第一次筛选出的杂交瘤细胞为何需进行克隆化培细胞为何需进行克隆化培养和专一抗体检测？养和专一抗体检测？5.5.实际操作中如何经过两次筛选获得能产生特异实际操作中如何经过两次筛选获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞？性抗体的杂交瘤细胞？有限稀释法有限稀释法稀释多次稀释多次稀释稀释将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法将培养皿

9、孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法有：酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。有：酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。1.动物特异性免疫动物特异性免疫2.分离分离B淋巴细胞（淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意）。注意B淋巴细淋巴细胞是一个系列。（胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）3.细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式:（BB;BG;GG）4.第一次筛选：在第一次筛选：在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞（只有（只有BG杂交瘤细胞存活。但杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：杂交瘤细胞也是一个系列：如如B1G,B2G

10、-BnG。而。而BB,GG在此培养基上不能存活。）在此培养基上不能存活。）5.第二次筛选：在第二次筛选：在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列每孔每孔只放一个杂交瘤细胞。只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进每个杂交瘤细胞，并进行行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是所需要的杂交的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。瘤细胞。6.选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射到或注射到小鼠腹腔小鼠腹腔内增殖内增殖。提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。4 4）、如何进行第）、如何进行第2 2次筛选

11、？次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第第1 1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2 2次筛选得次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：问题强化：1 1）、本过程利用了哪些原理？）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞

12、的遗传物质，不仅具有不仅具有B B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体本领，因而可以获得大量单克隆抗体 1、作为诊断试剂作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比与常规抗体相比,具有具有准确、高效、准确、高效、简易、快速简易、快速特点特点.2、用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗。主要用于癌症治疗。生物导弹：生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素放射性同位素+化学化学药物或细胞毒素药物或细胞毒

13、素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）胞位置，原位杀死癌细胞。）特异性强，灵敏度高，可大量制备。特异性强，灵敏度高，可大量制备。3 3、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案风杆菌单克隆抗体的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中、图中B为为_过程，常

14、用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50例例3 3：1.动物细胞工程技术的基础是：（）动物细胞工程

15、技术的基础是：（）A动物细胞融合动物细胞融合B胚胎移植胚胎移植C动物细胞培养动物细胞培养D核移植核移植课堂练习课堂练习;在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）确的是（）A结果是相同的结果是相同的B杂种细胞的形成过程基本相同杂种细胞的形成过程基本相同C操作过程中酶的作用相同操作过程中酶的作用相同D诱导融合的手段相同诱导融合的手段相同.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞A BC D C