模块一标本采集、血涂片制备与染色课件.ppt

1、主讲 魏彦刚第一章第一章 血液学一般检血液学一般检验（验（1、2）检验教研室绪绪 论论 一、临床检验（一、临床检验（clinical laboratory technology or science）又称实验诊断学，就是通过实验室的各种检查方法，包括感官检查、理学检查、化学检查、显微镜检查以及自动化仪器检查等，对病人的血液、体液、分泌物和排泄物等标本进行检查、分析，以获得病原、病理变化及脏器功能状态等资料。教学目标教学目标 1、了解血液的生理特性、了解血液的生理特性 2、掌握血液标本的采集方法及注意事项、掌握血液标本的采集方法及注意事项 3、掌握血液标本的采集部位、掌握血液标本的采集部位 4、

2、掌握血液标本的抗凝及抗凝剂、掌握血液标本的抗凝及抗凝剂 5、掌握血涂片的制备方法、掌握血涂片的制备方法教学内容教学内容 1、一般血液学检验概述、一般血液学检验概述 2、血液的生理特性、血液的生理特性 3、血液标本的采集、血液标本的采集 4、抗凝剂、抗凝剂 5、血涂片的制备、血涂片的制备教学重点教学重点教学重点：教学重点：血液标本的采集方法及注意事项血液标本的采集方法及注意事项 血液标本的采集部位血液标本的采集部位 血液标本的抗凝及抗凝剂血液标本的抗凝及抗凝剂教学难点教学难点 血液标本的抗凝血液标本的抗凝二、临床检验在医学中的作用 1、为准确诊断、及时治疗提供依据临床检验的结果是支持诊断、鉴别诊

3、断、甚至确定诊断的主要依据。例：anemia依据：血中红细胞和血红蛋白量减少leukemia依据：血象和骨髓象肾脏有实质性损伤的依据尿液中出现蛋白、细胞管型问：tumor？2、为分析病情、观察疗效、判断预后提供依据在疾病过程中，血液、体液、分泌物和排泄物也会随之发生相应的变化3、为预防疾病提供资料如血象和肿瘤细胞学的普查等三、临床检验的一般方法1、目视检查直接观察标本：颜色、透明度、性状，有无凝块或寄生虫2、理学检查液体的相对密度、血液比粘度、红细胞沉降率、红细胞比积等病理变化3、化学检查定性和定量检测标本化学成分的病理变化4、显微镜检查观察有型成分的数量和形态5、自动化仪器检查电子技术、程序

4、控制的发展四、学习临床检验的目的和要求1、理论联系实践2、操作要求3、检验结果必须和临床表现结合4、检验人员的医德第一章 血液学一般检验血液学检查 ：反应造血系统本身、机体全身或局部病变有助于疾病的诊断及疗效、预后的观察只能反应疾病某一方面的情况，不能认为是病程的全部反应；不同个体，对同一影响有不同的反应，或也可对不同影响产生相同的反应第一节 概论一、血液生理概要一、血液生理概要1.血液的组成血液的组成 血细胞（红细胞、白细胞、血小板）血血细胞（红细胞、白细胞、血小板）血浆组成浆组成 血清与血浆的概念和区别血清与血浆的概念和区别 血浆缺少某些凝血因子血浆缺少某些凝血因子 血细胞组成血细胞组成2

5、.血液主要的理化性质血液主要的理化性质（1）血量）血量 血浆量与血细胞量的总和血浆量与血细胞量的总和 成人约成人约45升，约占体重的升，约占体重的6%8%（2）颜色）颜色 红色红色,血红蛋白血红蛋白 动脉血动脉血:鲜红色。鲜红色。静脉血静脉血:暗红色。暗红色。严重贫血患者的血严重贫血患者的血:红色变浅。红色变浅。严重严重CO中毒或氰化物中毒中毒或氰化物中毒:樱红色樱红色 高脂膳食后血浆高脂膳食后血浆:呈乳白色呈乳白色 溶血溶血:呈不同程度的红色。呈不同程度的红色。（3）红细胞在血浆中的悬浮稳定）红细胞在血浆中的悬浮稳定性性 均匀混悬状态均匀混悬状态:1.红细胞膜唾液酸根红细胞膜唾液酸根带有负电

6、荷，形成带有负电荷，形成Zeta电位电位 2.血浆成分、血浆粘血浆成分、血浆粘度及血流动力学等度及血流动力学等（4）粘滞性）粘滞性 取决于血细胞比容和血浆粘度取决于血细胞比容和血浆粘度 健康成人健康成人:全血粘度为生理盐水粘度的全血粘度为生理盐水粘度的45倍倍 血浆粘度为生理盐水粘度的血浆粘度为生理盐水粘度的1.6倍左右倍左右（5）比重和渗透浓度）比重和渗透浓度 全血比重全血比重:男性约为男性约为1.0551.063女性约为女性约为1.0511.060；与红细胞的百分比有关与红细胞的百分比有关 血浆的比重约在血浆的比重约在1.0251.030之间，与蛋之间，与蛋白浓度有关。白浓度有关。血浆渗量

7、（渗透压）：血浆渗量（渗透压）：290310mOsm/kgH2O。（6）pH 血液血液pH值为值为7.357.45（7）凝固性）凝固性 与凝血因子激活有关与凝血因子激活有关3.血液的功能血液的功能 （1）运输功能）运输功能 氧气和营养成分氧气和营养成分（2）协调功能）协调功能 （3）维护机体内环境稳定）维护机体内环境稳定（4）防御功能）防御功能二、血液标本的采集二、血液标本的采集 1.毛细血管采血法毛细血管采血法 采血部位采血部位：左手中指或无名指指端内侧为左手中指或无名指指端内侧为宜，婴幼儿大趾及足底内外侧缘部采血，宜，婴幼儿大趾及足底内外侧缘部采血，严重烧伤的患者选择皮肤完整处采血。严重烧

8、伤的患者选择皮肤完整处采血。采血器材采血器材：带刃三棱针或一次性使用：带刃三棱针或一次性使用“专专用采血针用采血针”为好为好 穿刺深度：穿刺深度：3mm 采血顺序：血小板计数、红细胞计数、血采血顺序：血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数、血型鉴定。红蛋白测定、白细胞计数、血型鉴定。如图如图2.静脉采血法静脉采血法通常采用肘部静脉通常采用肘部静脉三、血液标本的抗凝三、血液标本的抗凝 抗凝：抗凝：用物理或化学的方法，除掉或抑制血液中用物理或化学的方法，除掉或抑制血液中某些凝血因子以阻止血液凝固的方法某些凝血因子以阻止血液凝固的方法 抗凝剂：抗凝剂：能阻止血液凝固的化学试剂能阻止血液凝固

9、的化学试剂常用化学抗凝剂：常用化学抗凝剂：1.枸橼酸钠（枸橼酸钠（trisodium citrate）也称柠檬酸钠配成也称柠檬酸钠配成109mmol/L或或106mmol/L的溶的溶液。液。抗凝原理：抗凝原理：枸橼酸钠与血液中的钙离子形成可溶性螯合物，枸橼酸钠与血液中的钙离子形成可溶性螯合物，阻止血液凝固。阻止血液凝固。Na3C6H5O7+Ca2+CaC6H5O7-+3Na+枸橼酸钠用于血栓与止血检验（枸橼酸钠用于血栓与止血检验（1:9）及红细胞）及红细胞沉降率（沉降率（1:4）等的测定，也多用于配制血液保）等的测定，也多用于配制血液保养液。养液。2.乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTA）盐）

10、盐 EDTA盐有二钠、二钾和三钾盐，与血液中的钙盐有二钠、二钾和三钾盐，与血液中的钙离子结合形成螯合物，从而阻止血液凝固。离子结合形成螯合物，从而阻止血液凝固。Na2C10H12O8N2+Ca2+CaC10H12O8N2+2Na+对血细胞形态和血小板计数影响较小，适用于多对血细胞形态和血小板计数影响较小，适用于多项血液检查，尤其是血小板计数。但其影响血小项血液检查，尤其是血小板计数。但其影响血小板聚集和白细胞吞噬功能，故不适于血栓与止血板聚集和白细胞吞噬功能，故不适于血栓与止血检查及血小板功能检查。检查及血小板功能检查。3.草酸钠草酸钠 与血液中的钙离子形成与血液中的钙离子形成 草酸钙沉淀阻止

11、血草酸钙沉淀阻止血液凝固。液凝固。Na2C2O4+Ca2+CaC2O4+2Na+4.双草酸盐抗凝剂双草酸盐抗凝剂 草酸钾可使红细胞草酸钾可使红细胞 ，草酸铵则可使红细，草酸铵则可使红细胞胞 ，按适当比例混合不影响红细胞形态和，按适当比例混合不影响红细胞形态和体积，可用于血细胞比容、血细胞计数、体积，可用于血细胞比容、血细胞计数、网织红细胞计数等项目网织红细胞计数等项目双草酸盐作用于RBC形态变化示意图草酸钾 草酸铵草酸铵l可使可使RBC缩小缩小 l可使可使RBCRBC胀大胀大草酸钾草酸钾:草酸铵草酸铵l RBC RBC形态、体积无变化形态、体积无变化 适用于测适用于测HctHct。5.肝素肝素

12、 肝素能阻止凝血酶形成肝素能阻止凝血酶形成 和抑制血小板聚集和抑制血小板聚集 肝素具有抗凝能力强，不影响血细胞体积，肝素具有抗凝能力强，不影响血细胞体积，不引起溶血不引起溶血 肝素会引起白细胞聚集，使血涂片染色产肝素会引起白细胞聚集，使血涂片染色产生蓝色背景，不能用于白细胞计数和分类生蓝色背景，不能用于白细胞计数和分类计数计数 四、血涂片的制备四、血涂片的制备 好的血涂片：厚薄适宜、头体尾分明、好的血涂片：厚薄适宜、头体尾分明、染色良好染色良好良好血涂片良好血涂片尾尾体体头头1.载玻片的清洁载玻片的清洁 新玻片常用浓度约新玻片常用浓度约1mol/L HCl浸泡浸泡24h后后用清水彻底冲洗，干燥

13、后备用。用清水彻底冲洗，干燥后备用。用过的载玻片可放入含适量肥皂或其它洗用过的载玻片可放入含适量肥皂或其它洗涤剂的清水中煮沸涤剂的清水中煮沸20min，趁热将血膜刷，趁热将血膜刷洗干净，再用清水反复冲洗干燥备用。洗干净，再用清水反复冲洗干燥备用。使用载玻片时，切勿用手触及玻片表面，以使用载玻片时，切勿用手触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻 2.血涂片的制备血涂片的制备 如图如图影响因素：影响因素：涂片的厚薄与血滴的大小、推片与载片之间的角涂片的厚薄与血滴的大小、推片与载片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。度、推片时的速度及血细胞比容有关。血

14、滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜越薄。血膜分布不匀主要是推片边缘不齐、血膜越薄。血膜分布不匀主要是推片边缘不齐、用力不匀和载玻片不清洁所致用力不匀和载玻片不清洁所致 血细胞比容高于正常时，血液粘度较高，保持血细胞比容高于正常时，血液粘度较高，保持较小的角度，可得满意结果；相反，血细胞比容较小的角度，可得满意结果；相反，血细胞比容低于正常时，血液较稀，则用较大角度。低于正常时，血液较稀，则用较大角度。五、血细胞常用的染色方法五、血细胞常用的染色方法（一）瑞氏染色法（一）瑞氏染色法 1.瑞氏染粉瑞氏染粉由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复由酸性染料

15、伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。伊红为钠盐，有色部分为阴离子。合染料。伊红为钠盐，有色部分为阴离子。美蓝为氯盐，有色部分为阳离子。美蓝和美蓝为氯盐，有色部分为阳离子。美蓝和伊红的水溶液混合后，产生一种不溶于水伊红的水溶液混合后，产生一种不溶于水的伊红化美蓝（的伊红化美蓝（ME）中性沉淀，即瑞氏染）中性沉淀，即瑞氏染料。料。将适量的将适量的ME溶解于甲醇中，即成为瑞氏染液。溶解于甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用：甲醇的作用：一方面使一方面使ME溶解，并解离为溶解，并解离为M+和和E-。这两种有。这两种有色离子可以选择性地与细胞内不同成分结合而着色离子可以选择性地与细胞内不同成分结合而着色。色

16、。另一方面因其具有强大的脱水作用，可将细胞固另一方面因其具有强大的脱水作用，可将细胞固定为一定形态。当细胞发生凝固时，蛋白质被沉定为一定形态。当细胞发生凝固时，蛋白质被沉淀为颗粒状或者网状结构，增加细胞结构的表面淀为颗粒状或者网状结构，增加细胞结构的表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。2.细胞的着色原理细胞的着色原理 既有既有化学的亲合作用化学的亲合作用，又有，又有物理的吸附作用物理的吸附作用。不同的细胞由于其所含化学成分不一样，化学性不同的细胞由于其所含化学成分不一样，化学性质各不相同，对染料的亲合力也不一样。质各不相同，对染料的亲合力也不一样

17、。细胞中的碱性物质与酸性染料伊红结合染成红细胞中的碱性物质与酸性染料伊红结合染成红色，称为色，称为嗜酸性物质嗜酸性物质，如血红蛋白及嗜酸性粒细，如血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等为碱性物质，与酸性伊胞胞质中的嗜酸性颗粒等为碱性物质，与酸性伊红结合而染成红色。红结合而染成红色。细胞中的酸性物质可与染液中的碱性染料美蓝细胞中的酸性物质可与染液中的碱性染料美蓝结合而染成蓝色，该物质又称结合而染成蓝色，该物质又称嗜碱性物质嗜碱性物质，如淋，如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞胞质内的颗粒为酸性巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞胞质内的颗粒为酸性物质，可与碱性染料美蓝结合染成蓝色。物质，可与碱性染料美蓝结合染成

18、蓝色。中性颗粒呈等电状态与伊红美蓝均可结合，染中性颗粒呈等电状态与伊红美蓝均可结合，染淡紫红色为中性物质。淡紫红色为中性物质。原始红细胞和早幼红细胞的胞质和细胞核的核原始红细胞和早幼红细胞的胞质和细胞核的核仁中含有较多的酸性物质，与美蓝亲合力强，故仁中含有较多的酸性物质，与美蓝亲合力强，故染成较浓厚的蓝色；随着细胞的发育，中幼红细染成较浓厚的蓝色；随着细胞的发育，中幼红细胞阶段既含有酸性物质，又含有碱性物质，既能胞阶段既含有酸性物质，又含有碱性物质，既能与碱性染料美蓝结合，又能与酸性染料伊红结合，与碱性染料美蓝结合，又能与酸性染料伊红结合，故染成红蓝色或灰红色；当红细胞完全成熟，酸故染成红蓝色

19、或灰红色；当红细胞完全成熟，酸性物质彻底消失后，只与伊红结合，则染成粉红性物质彻底消失后，只与伊红结合，则染成粉红色。色。3.pH对细胞染色的影响对细胞染色的影响 细胞着色对氢离子浓度十分敏感，蛋白质细胞着色对氢离子浓度十分敏感，蛋白质带正电荷即在酸性环境中正电荷增多，易带正电荷即在酸性环境中正电荷增多，易与酸性伊红结合，染色偏红；相反，当环与酸性伊红结合，染色偏红；相反，当环境的境的pHPi即在碱性环境中负电荷增多，即在碱性环境中负电荷增多，则易与美蓝结合染色偏蓝。则易与美蓝结合染色偏蓝。使用清洁中性的玻片，优质的甲醇配制染使用清洁中性的玻片，优质的甲醇配制染液以及常用缓冲液（液以及常用缓冲

20、液（pH6.46.8）来调节）来调节染色时的染色时的pH值值4.瑞氏染液的质量评价瑞氏染液的质量评价 除用血液片实际染色评价外，采用吸光度比值除用血液片实际染色评价外，采用吸光度比值（RA）作为瑞氏染液的质量评价指标）作为瑞氏染液的质量评价指标,瑞氏染液瑞氏染液的成熟指数以的成熟指数以RA（A650nm/A525nm）=1.30.1为宜。为宜。新配制的瑞氏染液往往偏碱，染色效果较差，需新配制的瑞氏染液往往偏碱，染色效果较差，需在室温或在室温或37下存放一定时间，待染液下存放一定时间，待染液“成熟成熟”。染液成熟的过程主要是染液成熟的过程主要是美蓝逐渐转变为天青美蓝逐渐转变为天青B的的过程过程。

21、在密封条件下，贮存时间愈久，转化的天。在密封条件下，贮存时间愈久，转化的天青青B愈多，染色效果愈好。愈多，染色效果愈好。5.染色结果分析染色结果分析 在正常情况下，在正常情况下，血膜外观呈淡紫红色血膜外观呈淡紫红色。显微镜。显微镜下，红细胞呈下，红细胞呈粉红色粉红色。白细胞胞质中颗粒清楚，。白细胞胞质中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩，细胞核染紫红并显示出各种细胞特有的色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。色，核染色质结构清楚。染色偏酸则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红，染色偏酸则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红，白细胞核呈淡蓝色或不着色白细胞核呈淡蓝色或不着色。染色偏碱则所有细胞呈灰蓝色，颗粒深暗染色偏碱则所有细胞呈灰蓝色，颗粒深暗；嗜；嗜酸性粒细胞可染成暗褐色，甚至紫黑色或蓝色；酸性粒细胞可染成暗褐色，甚至紫黑色或蓝色；中性颗粒偏粗，染成紫黑色。中性颗粒偏粗，染成紫黑色。（二）吉姆萨染色法（二）吉姆萨染色法 染色原理与染色原理与wright染色法大致相同染色法大致相同 本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更为清晰，但细胞质和颗粒着色较差，示更为清晰，但细胞质和颗粒着色较差，