放射性免疫药盒(本科课程)课件.ppt

1、第七章第七章 放射免疫分析试剂盒的制备放射免疫分析试剂盒的制备一、概要一、概要二、放射免疫分析试剂盒主要组分的制备技术二、放射免疫分析试剂盒主要组分的制备技术三、典型放射免疫分析试剂盒的制备三、典型放射免疫分析试剂盒的制备四、免疫分析技术进展四、免疫分析技术进展 放射性同位素在医学上的应用放射性同位素在医学上的应用 相机相机 1 体内诊断（核医学影像学体内诊断（核医学影像学)SPECT PET 2 治疗（放射治疗药物、种子源）治疗（放射治疗药物、种子源）3 体外检测（放射免疫分析）体外检测（放射免疫分析）一、一、概要概要概要概要概念与原理概念与原理主要的放射标记免疫分析方法主要的放射标记免疫分

2、析方法放射标记免疫分析方法的特点放射标记免疫分析方法的特点放射免疫分析技术（放射免疫分析技术（RIA）是基于免疫分析的特异性与放射性是基于免疫分析的特异性与放射性测量的高灵敏性而建立的一种超微量分析方法，能够定量检测生测量的高灵敏性而建立的一种超微量分析方法，能够定量检测生物体内成百上千种活性物质，是现代生物、医学和临床诊断的重物体内成百上千种活性物质，是现代生物、医学和临床诊断的重要手段。要手段。1 概念与原理概念与原理 以放射性核素（主要为以放射性核素（主要为125I,57Co,3H,14C等）标记抗原，抗等）标记抗原，抗体，配基或受体，在体外条件下，经过不同的结合反应（竞争体，配基或受体

3、，在体外条件下，经过不同的结合反应（竞争或非竞争性的），再将结合和未结合的标记物分开，测量其放或非竞争性的），再将结合和未结合的标记物分开，测量其放射性活度，从而计算各种生物活性物质的含量。射性活度，从而计算各种生物活性物质的含量。基本原理基本原理 抗原抗原(Antigen)：能刺激动物机体的免疫活性细胞产生抗体能刺激动物机体的免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内外与其发生特异性反应（结合）的或致敏淋巴细胞，并在体内外与其发生特异性反应（结合）的物质。一般为异种或异体物质（即物质。一般为异种或异体物质（即机体的免疫活性细胞从未接机体的免疫活性细胞从未接触过的异物触过的异物）。）。完全抗

4、原：完全抗原：具有上述两种特性，即单独能刺激动物机体产具有上述两种特性，即单独能刺激动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，又能与这些产物在体内外发生特异性生抗体或致敏淋巴细胞，又能与这些产物在体内外发生特异性结合生成抗原结合生成抗原-抗体复合物。大多为大分子量的蛋白质。抗体复合物。大多为大分子量的蛋白质。半抗原半抗原(Half Antigen,Hapten)：单独不能刺激动物机体产单独不能刺激动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，但能与相应的抗体或致敏淋巴细胞起生抗体或致敏淋巴细胞，但能与相应的抗体或致敏淋巴细胞起特异性结合反应生成抗原特异性结合反应生成抗原-抗体复合物的物质。与载体结合后注抗体复合物的物

5、质。与载体结合后注入动物体内能诱导抗体形成，即成为完全抗原。入动物体内能诱导抗体形成，即成为完全抗原。抗体抗体(Antibody)：由抗原诱导形成的一种血清球蛋白，与抗原由抗原诱导形成的一种血清球蛋白，与抗原结合形成结合形成抗原抗原-抗体复合物。抗体复合物。特异性特异性(Specificity)：抗体抗原反应具有特异性，即一种抗体抗体抗原反应具有特异性，即一种抗体（抗原）只能与相应的抗原（抗体）结合，不能与其它无关的抗（抗原）只能与相应的抗原（抗体）结合，不能与其它无关的抗原（抗体）结合。原（抗体）结合。哺乳动物哺乳动物IgGIgAIgM人体人体IgGIgAIgMIgDIgE主要的放射免疫分析

6、方法主要的放射免疫分析方法放射免疫分析（放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA）免疫放射量度分析（免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay,IRMA）受体放射性配体结合分析（受体放射性配体结合分析（Receptor Radio-ligand Bonding Assay,PRLBA）放射受体分析（放射受体分析（Radio-Receptor Assay,RRA）2 主要的放射标记免疫分析方法主要的放射标记免疫分析方法 1958-1960年由年由Yalow RS and Breson SA创建，为最早的放射标记创建，为最早的放射标记免疫分析方法。免疫分析方法。

7、（1977年获得了诺贝尔生物医学奖）。年获得了诺贝尔生物医学奖）。原理：原理：用放射性核素标记抗原，标记抗原与非标记抗原同时竞争结用放射性核素标记抗原，标记抗原与非标记抗原同时竞争结合物（如抗体）上有限的结合位点。然后将结合与未结合的游离抗原合物（如抗体）上有限的结合位点。然后将结合与未结合的游离抗原分离，测定其放射性分布，利用标准曲线确定样本中待测物的含量。分离，测定其放射性分布，利用标准曲线确定样本中待测物的含量。1)放射免疫分析（放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA）Ag*+Ag+Ab Ag*-Ab+Ag-Ab游离物（游离物（F）复合物（复合物（B）对于对于RIARIA

8、，应满足以下条件：，应满足以下条件：抗原是纯一的，只由一种化学成分组成；抗原是纯一的，只由一种化学成分组成；抗体也仅由一种化学成分组成；抗体也仅由一种化学成分组成；抗原与抗体均为单价，即一分子抗原只能和一分子抗体反应；抗原与抗体均为单价，即一分子抗原只能和一分子抗体反应；标记的和未标记的抗原具有相同的物理标记的和未标记的抗原具有相同的物理-化学性质；化学性质；抗原抗原-抗体反应遵循质量作用定律；抗体反应遵循质量作用定律；反应达到平衡；反应达到平衡；结合抗原和未结合的游离抗原能完全分开，且不破坏反应平衡；结合抗原和未结合的游离抗原能完全分开，且不破坏反应平衡；能准确测量结合抗原和游离抗原之比，或

9、结合抗原与总抗原之比。能准确测量结合抗原和游离抗原之比，或结合抗原与总抗原之比。K1Ag+Ab AgAb k-1 K（亲和常数）（亲和常数）=(AgAb）/Ag Ab k-1 b/f=（AgAb）/(Ag)=K(Ab)b/f=K(AbT-B)K1 放射免疫分析的放射免疫分析的Scatchard图图2)免疫放射量度分析（免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay,IRMA）在在RIA基础上建立起来的标记免疫分析方法。基础上建立起来的标记免疫分析方法。原理：原理：用放射性核素标记抗体，以过量的标记抗体与抗原结合用放射性核素标记抗体，以过量的标记抗体与抗原结合建立的方法建立的方

10、法.免疫放射量度分析原理示意图免疫放射量度分析原理示意图 IRMA剂量反映曲线剂量反映曲线 RIA反映曲线反映曲线RIA与与IRMA反应式比较反应式比较方法方法反应式反应式分离方法分离方法RIAAg*+Ag+Ab Ag*-Ab+Ag-Ab（定量抗体）（定量抗体）液相分离液相分离固相分离固相分离IRMAAg+Ab*Ag-Ab*+Ab*Ag+Ab*+固相固相Ab 固相固相Ab-Ag-Ab*+Ab*（过量抗体）（过量抗体）免疫吸附剂免疫吸附剂或固相分离或固相分离RIA与与IRMA的工作原理主要区别的工作原理主要区别RIAIRMA1 竞争性免疫结合分析竞争性免疫结合分析2 反应体系中有抗原、标记抗原和

11、抗体反应体系中有抗原、标记抗原和抗体3 标记抗原标记抗原4 在标准曲线剂量反应体系中结合率越在标准曲线剂量反应体系中结合率越大，剂量越小，反之，则越大大，剂量越小，反之，则越大5 免疫结合反应慢免疫结合反应慢1 非竞争性免疫结合分析非竞争性免疫结合分析2 反应体系中有固相抗原、抗原与标记抗体反应体系中有固相抗原、抗原与标记抗体3 标记抗体标记抗体4 在标准曲线剂量反应体系中随结合率增高剂在标准曲线剂量反应体系中随结合率增高剂量值也随之增大量值也随之增大5 免疫结合反应快免疫结合反应快特点特点特异性很强，即使化学结构很接近；特异性很强，即使化学结构很接近；灵敏度高，可达灵敏度高，可达10-14m

12、ol/L;精确度较高，放射性活度探测不易受干扰；精确度较高，放射性活度探测不易受干扰；应用范围较广，适用于多种化学结构；应用范围较广，适用于多种化学结构；操作简单，分析速度快，样品不需预处理。操作简单，分析速度快，样品不需预处理。3 放射标记免疫分析方法的特点放射标记免疫分析方法的特点主要组分主要组分标记物标记物标准品标准品抗血清抗血清分离剂分离剂质控血清质控血清二、二、放射标记免疫试剂盒主要组分的制备技术放射标记免疫试剂盒主要组分的制备技术（一）标记物的制备技术（一）标记物的制备技术核素核素半衰期半衰期衰变方式及衰变方式及分支比分支比主要射线及能量主要射线及能量(keV,%)生产方式生产方式

13、3H12.3y-(100)-18.61(100)6Li(n,a)3H14C5730y+(99.8)EC(0.2)-155(100)14N(n,p)14C35S87.5d-(100)-167.4(100)35Cl(n,p)35S57Co271.8dIT(100)122(85.5)56Fe(d,n)57Co75Se119.8dEC(100)136(58)74Se(n,r)75Se125I60.1dEC(100)28-35124Xe(n,r)125Xe 125I 可用于放射免疫分析的放射性核素可用于放射免疫分析的放射性核素射线易于探测射线易于探测半衰期适中半衰期适中易于标记易于标记蛋白质的蛋白质的I

14、标记标记直接氧化亲电法直接氧化亲电法间接标记法间接标记法氯胺氯胺T法（法（Chloramine-T,Ch-T）酶促标记法酶促标记法Iodogen(氯甘尿法氯甘尿法)Bolton-Hunter（BH）方法）方法 其它间接标记法其它间接标记法 1 125I的标记的标记2 标记物的分离纯化标记物的分离纯化分离纯化方法分离纯化方法离子交换色谱法离子交换色谱法凝胶色谱凝胶色谱(Sephadex)法法薄层色谱法薄层色谱法高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)3 标记物的质量鉴定标记物的质量鉴定质量评价参数质量评价参数核素核素(125I)利用率利用率放化纯放化纯(85%)比活度比活度(80%)免疫活性免疫活性

15、(过量抗体结合率过量抗体结合率)4 标记物的稳定性及贮存条件标记物的稳定性及贮存条件多肽类标记物通常采用冷冻干燥方法贮存多肽类标记物通常采用冷冻干燥方法贮存;小分子化合物及单抗标记物可以液体状态贮存小分子化合物及单抗标记物可以液体状态贮存;标记物通常在标记物通常在2-8条件下保存，有效期约周。条件下保存，有效期约周。（二）抗原和抗体的制备技术（二）抗原和抗体的制备技术免疫原（抗原）的制备免疫原（抗原）的制备免疫原的制备免疫原的制备采用生化技术提取采用生化技术提取(人体器官或体液）人体器官或体液）采用偶联技术制备采用偶联技术制备亲和层析法亲和层析法分子筛法分子筛法离子交换法离子交换法高效液相色谱

16、法高效液相色谱法2 抗体制备抗体制备抗体抗体多克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 动物种属选择动物种属选择动物动物家兔家兔绵羊绵羊豚鼠等豚鼠等 免疫增强剂免疫增强剂注射方式注射方式皮内注射皮内注射皮下注射皮下注射腹腔注射腹腔注射静脉注射静脉注射 凡可增强被免疫动物免疫应答反应的物质均可称为免疫增强凡可增强被免疫动物免疫应答反应的物质均可称为免疫增强剂，剂，其种类众多。其种类众多。免疫免疫注射部位注射部位背部背部腹股沟腹股沟足垫足垫抗血清的质量鉴定抗血清的质量鉴定质量鉴定质量鉴定亲和性亲和性特异性特异性滴度滴度抗体贮存抗体贮存抗血清加入抗血清加入0.1%-0.2%防腐剂，按需要量分装、冻干，

17、防腐剂，按需要量分装、冻干，-50贮存。贮存。（三）单克隆抗体的制备（三）单克隆抗体的制备 1975年由年由Kohler和和Milsten采用杂交瘤技术第一次获得。采用杂交瘤技术第一次获得。基本原理：基本原理：利用动物脾细胞即淋巴细胞可以分泌特异抗体，利用动物脾细胞即淋巴细胞可以分泌特异抗体，而骨髓瘤能够在体外连续培养的性质，将两种细胞在融合剂（通而骨髓瘤能够在体外连续培养的性质，将两种细胞在融合剂（通常为常为PEG）的作用下进行融合，）的作用下进行融合，获得既可分泌特异抗体又可在体获得既可分泌特异抗体又可在体外连续进行培养的杂交瘤细胞。外连续进行培养的杂交瘤细胞。因此，这种杂交瘤细胞就能在细

18、因此，这种杂交瘤细胞就能在细胞培养中产生大量单一类型的高纯度抗体。胞培养中产生大量单一类型的高纯度抗体。单克隆抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于单克隆抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体多克隆抗体/多株抗体多株抗体由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。小鼠免疫小鼠免疫细胞融合细胞融合筛筛 选选克隆化克隆化扩大培养扩大培养注如小鼠注如小鼠诱发腹水诱发腹水单克隆抗体单克隆抗体制备过程制备过程质量鉴定质量鉴定抗体滴度抗体滴度亲和常数亲和常数交叉反应交叉反应免疫球蛋白类型、亚类免疫球蛋白类型、亚类特特 点点高度匀质性高度匀质性高度特异性

19、高度特异性来源稳定、可大量生产来源稳定、可大量生产缺点缺点热稳定性较差热稳定性较差亲和性较低亲和性较低价格较高价格较高与多克隆抗体比较与多克隆抗体比较（四）分离剂（四）分离剂 分离剂的作用是将分析体系中游离部分与结合部分进行有效分离剂的作用是将分析体系中游离部分与结合部分进行有效的分离，直接影响的分离，直接影响RIA测量结果的准确性。测量结果的准确性。分离剂分离剂PR试剂试剂(双抗体与聚乙二醇双抗体与聚乙二醇 沉淀法沉淀法)磁性分离剂磁性分离剂试管固相法试管固相法分离效果好分离效果好操作简便操作简便易于大批量自动化分析易于大批量自动化分析（五）标准品与参考血清的制备（五）标准品与参考血清的制备

20、1 标准品标准品要要 求求与被测物具有相同的化学结构和免疫活性与被测物具有相同的化学结构和免疫活性来源充足、价格便宜来源充足、价格便宜稳定、均匀一致稳定、均匀一致量值准确量值准确标准品标准品化学纯品制备化学纯品制备（被测物质结构清楚、可用化学方法合成）（被测物质结构清楚、可用化学方法合成）类似物制备类似物制备（被测物质结构不确定、难以用化学方法合成）（被测物质结构不确定、难以用化学方法合成）2 参考血清参考血清 一般含一个或几个分析物，是免疫分析中用来比较和评价不一般含一个或几个分析物，是免疫分析中用来比较和评价不同测定系统的偏倚和重复性的血清，也是用于内部或外部质量评同测定系统的偏倚和重复性

21、的血清，也是用于内部或外部质量评价的主要试剂。价的主要试剂。作用作用计算实验结果误差（批内、批间精密度）计算实验结果误差（批内、批间精密度）分析误差原因并进行处理分析误差原因并进行处理监督放免试剂盒稳定性监督放免试剂盒稳定性判断分析数据可靠性判断分析数据可靠性要求要求与待测物质相近与待测物质相近配制的浓度应在测定的工作范围之内配制的浓度应在测定的工作范围之内（配制高、中、低三种剂量水平）（配制高、中、低三种剂量水平）稳定、数量能满足较长时间使用稳定、数量能满足较长时间使用（六）数据处理与分析方法的有效性评估（六）数据处理与分析方法的有效性评估评估的内容评估的内容特异性特异性灵敏度灵敏度精密度精

22、密度准确性准确性健全性健全性稳定性稳定性非特异结合非特异结合最大结合最大结合三、几种典型放射免疫分析试剂盒的制备三、几种典型放射免疫分析试剂盒的制备（一）甲状腺素放射免疫分析试剂盒的制备（一）甲状腺素放射免疫分析试剂盒的制备（二）游离甲状腺素（二）游离甲状腺素FT4试剂盒的制备试剂盒的制备（三）人血清促甲状腺激素免疫放射分析试剂盒的制备（三）人血清促甲状腺激素免疫放射分析试剂盒的制备四、免疫分析技术进展四、免疫分析技术进展国际市场国际市场市场规模接近市场规模接近300亿美元，近期每年增长率在亿美元，近期每年增长率在7-9%左右左右。特点特点 检测品种多，达近千种，并且还在持续增加；检测品种多，

23、达近千种，并且还在持续增加；同一公司有多个产品技术平台；同一公司有多个产品技术平台；多种免疫分析方法并存，相互竞争，相互补充；多种免疫分析方法并存，相互竞争，相互补充；大公司产品系列全，小公司产品有特色；大公司产品系列全，小公司产品有特色；高度集成、自动化的仪器诊断与简单、快速便于普及的快速诊断。高度集成、自动化的仪器诊断与简单、快速便于普及的快速诊断。国国 内内 200余厂家；余厂家；北京北方生物技术研究所北京北方生物技术研究所 潍坊三维生物工程集团有限公司潍坊三维生物工程集团有限公司 北京科美东雅生物技术有限公司北京科美东雅生物技术有限公司 原子高科股份有限公司原子高科股份有限公司 100

24、余种系列产品；余种系列产品；市场规模市场规模40亿元（国内与国外各占一半）；亿元（国内与国外各占一半）；年增长率年增长率10-16%；面临的挑战面临的挑战 酶免疫分析酶免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved Fluoroimmunoassay,TRF)化学发光免疫分析化学发光免疫分析(Chemiluminesent immunoassay,CLIA）放射免疫分析和非放射免疫分析技术性能比较放射免疫分析和非放射免疫分析技术性能比较种类种类RIAELISATRFIACLIA示踪物

25、示踪物125I酶酶Eu3+酶，吖啶酯酶，吖啶酯反应条件反应条件液固液固固固固固固固操作程序操作程序简易简易简易简易简易简易简易简易分析自动化分析自动化否否否否可可可可分离分离B、F离心、洗涤离心、洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤稳定性稳定性高高较差较差高高高高标记物有效期标记物有效期短短较长较长长长长长影响因素影响因素少少多多多多少少温育时间温育时间长长较短较短长长较短较短价格价格低低低低高高高高政策环境政策环境较严格较严格宽松宽松宽松宽松宽松宽松传统的传统的RIA使用市场可能会逐渐缩小！使用市场可能会逐渐缩小！预计在未来十年中，体外诊断技术将会快预计在未来十年中，体外诊断技术将会快速发展，并出现放免、酶免、化学发光、时间速发展，并出现放免、酶免、化学发光、时间分辨荧光以及金标试纸条、生物芯片等多种体分辨荧光以及金标试纸条、生物芯片等多种体外诊断试剂优势互补，各自在不同领域广泛应外诊断试剂优势互补，各自在不同领域广泛应用共存，国内和国外厂家纷争的竞争局面。用共存，国内和国外厂家纷争的竞争局面。