微生物菌种课件.ppt

1、第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育发酵工程工业生产水发酵工程工业生产水平的三个决定要素平的三个决定要素 生产菌种的性能生产菌种的性能发酵和提取工艺条件发酵和提取工艺条件生产设备生产设备获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节工业生产的第一环节.第一节第一节 菌种来源菌种来源工业发酵常见微生物种类工业发酵常见微生物种类 发酵工业上常见的微生物有细菌、发酵工业上常见的微生物有细菌、酵母、霉菌和放线菌。酵母、霉菌和放

2、线菌。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育细菌细菌醋酸杆菌（Acetobacter），用于生产醋酸和维生素C。假单胞菌(Pseudomonas)，荧光假单胞菌发酵生产2-酮基D-葡萄糖酸。乳酸菌（Lactobacillus），发酵生产乳酸。大肠杆菌（E.coli），生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸。枯草芽孢杆菌生产淀粉酶、蛋白酶和某些氨基酸、肌苷、5-肌苷酶等。梭状芽孢杆菌生产丙酮-丁醇。北京棒杆菌生产谷氨酸。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育酵母菌酵母菌酿酒酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae

3、）：发面和）：发面和酿酒及分子生物学用。酿酒及分子生物学用。假丝酵母属（假丝酵母属（Candida）：生产）：生产SCPSCP。汉逊氏酵母属：产乙酸乙酯。汉逊氏酵母属：产乙酸乙酯。毕赤酵母属（毕赤酵母属（Pichia）：工业污染菌。）：工业污染菌。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育霉菌霉菌曲霉属（曲霉属（Aspergillus）：黑曲霉（）：黑曲霉（A.niger）生产柠檬酸、）生产柠檬酸、草酸、葡萄糖酸、糖化酶、酸性蛋白酶、果胶酶、单宁酶草酸、葡萄糖酸、糖化酶、酸性蛋白酶、果胶酶、单宁酶等；米曲霉（等；米曲霉（A.oryzae）用于酿酒和）用于酿酒和L-L-乳酸生产

4、。乳酸生产。青霉属（青霉属（Penicillum），生产青霉素，桔青霉（），生产青霉素，桔青霉（P.citrinum）可产生可产生55磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。根霉属（根霉属（R Rhizopus）用于米酒和黄酒生产，）用于米酒和黄酒生产，还用于淀粉糖化菌、有机酸发酵及甾体转化。还用于淀粉糖化菌、有机酸发酵及甾体转化。毛霉（毛霉（Mucor）产生蛋白酶，生产腐乳、酱）产生蛋白酶，生产腐乳、酱 油，进行甾体转化。油，进行甾体转化。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育放线菌放线菌最大的经济价值在于产生多种抗生素最大的经济

5、价值在于产生多种抗生素链霉菌（链霉菌（Streptomyces）发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育放线菌（链霉放线菌（链霉素四环素；红素四环素；红霉素等）霉素等）真菌（青霉素、真菌（青霉素、头孢等）头孢等）一些产芽孢的细菌一些产芽孢的细菌植物或动物来源植物或动物来源食用菌和藻类食用菌和藻类发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育工业微生物来源工业微生物来源想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。菌株。从自然界采集分离。从自然界采集分离。从一些发酵制品中分离目的菌株。从一些发酵制品中分离目的菌株。发酵

6、工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育微生物菌种的选择性分离微生物菌种的选择性分离工业化菌种的要求工业化菌种的要求l 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；成产物；l 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；的可操作性要强；l 遗传性能要相对稳定；遗传性能要相对稳定；l 不易感染它种微生物或噬菌体；不易感染它种微生物或噬菌体；l 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病致病 菌无关）；菌无关）

7、；l 生产特性要符合工艺要求。生产特性要符合工艺要求。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育菌种分离的一般过程菌种分离的一般过程土样的采取土样的采取 富集富集 分离分离 目的菌的筛选目的菌的筛选如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：问题：发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 调查研究（包括资料查阅）调查研究（包括资料查阅）试验方案设计试验方案设计 采样采样第一次增殖培养第一

8、次增殖培养第一次平板分离第一次平板分离第二次增殖培养第二次增殖培养第二次平板分离第二次平板分离增殖条件探索增殖条件探索根据实际情况进根据实际情况进行定量或半定量行定量或半定量测定测定第一次原种斜面第一次原种斜面第二次原种斜面第二次原种斜面初筛（初筛（1株株1瓶）瓶）定量或半定量测定定量或半定量测定筛筛 选选 工工 作作 程程 序序第三次平板分离第三次平板分离第三次原种斜面第三次原种斜面复筛复筛第四次平板分离第四次平板分离不纯不纯第四次原种斜面第四次原种斜面再复筛再复筛种子培养种子培养初步工艺条件摸索初步工艺条件摸索较优菌株较优菌株1株株3-5瓶瓶保藏及进一步做生产性能试保藏及进一步做生产性能试

9、验或作为育种的出发菌株验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验某些必要试验和毒性试验第三次菌种保藏第三次菌种保藏分离与筛选的设计要求分离与筛选的设计要求在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：1、菌的营养特征、菌的营养特征一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料富的原料2、菌的生长温度、菌的生长温度3、菌的稳定性、菌的稳定性4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性、菌对所采用的设备和生产过程的适应性6、容易从培养液中回收产物、容易从培养液中

10、回收产物3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株便有希望成为效益高的生产菌株发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育较复杂；应根据分离目的灵活掌握土壤土壤（丰富、5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）食品、海水、动物、植物、极端环境 根据微生物的营养类型采样根据微生物的营养类型采样森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌根据微生物

11、的生理特性采样根据微生物的生理特性采样筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育采样时要注意的问题采样时要注意的问题 富集的三种方案：q 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件（加热、膜过滤等），进行培养。目的微生物富集的一些基本方法目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。q 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，q 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，

12、这 时只能通过随机分离的办法发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育定向培养的富集方法定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育目的菌的分离和筛选目的菌的分离和筛选q 从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素q 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖菌落的外观

13、形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。上就可以初步识别。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育透明圈法透明圈法 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；脂肪酶、核酸酶等；在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；养基混浊；能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。圈

14、，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在后铺在pH8-9pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。蛋白质，产生一透明圈。例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明

15、圈分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛法初筛 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈。明圈。透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。并不完全成正比。但作为初筛的手段是有意义的但作为初筛的手段是有意义的如何分离磷细菌？如何分离磷细菌？发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育

16、变色圈法变色圈法 对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 用含用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果刚果红溶液染色红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水

17、解圈。出现绛红色水解圈。如如筛选果胶酶产生菌筛选果胶酶产生菌甘油三丁酸酯为底物甘油三丁酸酯为底物罗丹明罗丹明B为指示剂为指示剂荧光圈荧光圈又如又如 分离解脂微生物分离解脂微生物豆油作底物豆油作底物中性红中性红（红黄（红黄.6.88.0.）指示指示菌落周围呈红色圈菌落周围呈红色圈发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育生长圈法生长圈法 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌维生素的产生菌将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养

18、物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈落周围便会形成一个混浊的生长圈 工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育抑菌圈法抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的分离筛选常用于抗生素产生菌的分离筛选据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选

19、模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法 工具菌采用抗生素的敏感菌工具菌采用抗生素的敏感菌若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等试验菌的选择是关键（关系到灵敏度、活性、抗菌谱等）试验菌的选择是关键（关系到灵敏度、活性、抗菌谱等）采用联合试验菌（枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭状芽孢杆菌）分离到黄霉素

20、采用专一性强的筛选技术也是检出新抗生素的有效方法主要是利用抗生素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活剂等建立的筛选技术如棒酸（clavulanic acid）的发现：通过鉴定氨苄青霉素和待测样品对-内酰胺酶产生菌克雷氏菌的协同抑制作用发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离 临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质酸或抑制核酸生物合成的物质 大部分具有抗菌或抗真菌的活性大部分具有抗菌或抗真菌的活性 现发展出利用微生物筛选作用于现发展出利用微生物筛选作用于DNA DNA

21、的抗肿的抗肿瘤药物的方法，如瘤药物的方法，如生化诱导分析法生化诱导分析法发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育酶抑制剂产生菌的分离酶抑制剂产生菌的分离 某些酶与病理相关某些酶与病理相关 如果某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶，如果某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用它就可能在体内有药理作用 选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶 靶靶 区区 靶靶 酶酶抗高血压抗高血压 血管紧张素转移酶血管紧张素转移酶抗糖尿病抗糖尿病 -淀粉酶、蔗糖酶等淀粉酶、蔗糖酶等抗血脂症抗血脂症 缩合酶缩合酶抗组氨抗组氨 组氨酸脱羧酶、组

22、氨组氨酸脱羧酶、组氨-N-甲基转移酶甲基转移酶发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育生长因子产生菌的分离生长因子产生菌的分离 通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检测生长因子产生菌。来检测生长因子产生菌。分离培养基上培养被杀死的菌落周围有无检测菌的生长圈影印到能支持生长因子产生菌生长的培养基上Uv照射杀死菌落铺上一层含相应生长因子缺陷型菌株发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育第二节第二节 发酵高产菌种选育发酵高产菌种选育 菌种选育是菌种选育是应用微生物遗传和变异理论，用人工方应用微生物遗传和变异

23、理论，用人工方法法(或自然或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程种的过程 。菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。菌种选育的方向是选育菌种选育的方向是选育“吃粗粮吃粗粮”、耐高温、生长、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。微生物育种的方法包括自然育种、诱变育种、细胞微生物育种的方法包括自然育种、诱变育种、细胞工程育种和工程育种和DNADNA重组技

24、术育种等。重组技术育种等。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育自然选育自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。而进行菌种筛选的过程叫自然选育。自发突变自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。着这种突变是没有原因的。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育自然突变两种情况：自

25、然突变两种情况：生产上所不希望的：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下菌种的衰退和生产质量下 降降 对生产有益的：对生产有益的：生产性能提高生产性能提高制备单孢子（单细胞）悬液制备单孢子（单细胞）悬液 适当稀释适当稀释在固体平板上分离在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株自然选育的一般程序自然选育的一般程序发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定

26、生产、提高产量等目的。止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。难使生产水平大幅度提高。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 诱变育种诱变育种诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品诱变育种不仅可以提高菌

27、种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。质量、扩大品种和简化生产工艺。目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为年开始生产时的效价仅为20U/ml，通过多，通过多次诱变育种现已达次诱变育种现已达50000-100000U/ml。虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。前广泛使用的育种手段。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育原始菌株（出发菌株）原始菌株

28、（出发菌株）活细胞计数活细胞计数诱变剂处理诱变剂处理活细胞计数活细胞计数中间培养中间培养突变株分离突变株分离初筛初筛复筛复筛生产性能试验生产性能试验诱变预备处诱变预备处理理诱诱 变变 育育 种种 的的 工工 作作 程程 序序发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育1 1、出发菌株的选择出发菌株的选择选择时注意以下几点：选择时注意以下几点：1）选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株。）选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株。2）最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。）最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。3）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快

29、，营）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营养要求低等。养要求低等。4）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。菌株。例如，在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色素例如，在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育2 2、单细胞（或单孢子）悬液制备、单细胞（或单孢子）悬液制备 一般

30、均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。液进行诱变处理。因为因为 1 1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂；）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂；2 2）可避免长出不纯的菌落）可避免长出不纯的菌落 处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态，处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态，细胞菌龄一般在对数期，霉菌的菌丝一般是多核细胞菌龄一般在对数期，霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 若在处理前细胞进行前培养，则变异率可大大若在处

31、理前细胞进行前培养，则变异率可大大提高。提高。同步化前培养的具体做法：同步化前培养的具体做法：接种培养接种培养24h24h的斜面入的斜面入50ml50ml基本培养基中，基本培养基中，3737 C C振荡培振荡培养养16h16h，然后在，然后在6C6C放置放置1h1h，以得到同步生长和分裂。将菌，以得到同步生长和分裂。将菌体离心并悬浮于营养丰富的前培养基中，体离心并悬浮于营养丰富的前培养基中，37C37C振荡培养振荡培养30-30-50min50min。立即降至。立即降至2C2C保藏保藏10min10min，再离心洗涤两次，悬浮于，再离心洗涤两次，悬浮于冷生理盐水中。经分散、过滤、调整细胞密度，

32、制备成菌冷生理盐水中。经分散、过滤、调整细胞密度，制备成菌悬液，供处理用。悬液，供处理用。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育3 3、诱变剂及使用剂量的选择、诱变剂及使用剂量的选择凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂诱变剂。如紫外线、如紫外线、X-射线、射线、-射线、快中子、射线、快中子、超声波等超声波等 硫酸二乙酯硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍、亚硝基胍(NTG)、亚硝酸亚硝酸(NA)、氮芥、氮芥(NM)、羟胺、羟胺、ICR类类等等诱变剂诱变剂物理诱变剂物理诱变剂化学诱变剂化学诱变剂发酵工程发酵工程 第二章第二章

33、微生物菌种选育微生物菌种选育紫外线紫外线(Uv)使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应用较广用较广 对诱变最有效的波长是对诱变最有效的波长是260nm260nm左右左右(253-265nm)(253-265nm)作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNADNA生物活性生物活性,造成菌体变异甚至死亡造成菌体变异甚至死亡.发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育快中子快中子 中子是不带电荷的粒子，可由回旋加速器、静电减速器或中子是不带电荷的粒子，可由回旋加速器、静电减速器或原子反应堆产生。原子反应

34、堆产生。中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子，因而快中子的生物学效应几乎完全是由质子造成的。出质子，因而快中子的生物学效应几乎完全是由质子造成的。中子分为快中子和慢中子。快中子的能量为中子分为快中子和慢中子。快中子的能量为0.2-10百万电子百万电子伏特，慢中子能量为伏特，慢中子能量为1/4至至100电子伏特。电子伏特。慢中子的效应同慢中子的效应同 射线、射线、射线和电子等照射时引起的基本射线和电子等照射时引起的基本相同，快中子较相同，快中子较X射线、射线、射线具有较大的电离密度，因而能射线具有较大的电离密度，因而能更多地引

35、起点突变和染色体畸变。更多地引起点突变和染色体畸变。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育氮氮 芥芥 氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一般使用的是其盐酸盐。粉末，一般使用的是其盐酸盐。应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠其作用，释应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠其作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。氮芥的诱变机制是它能引起染色体畸变。是被氮芥的诱变机制是它能引起染色体畸变。是被使用得最早的一种诱变剂。使用得最早的一种诱变剂。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物

36、菌种选育亚硝酸亚硝酸 常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。亚硝酸亚硝酸A H（次黄嘌呤（次黄嘌呤）C UG X（黄嘌呤（黄嘌呤）亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐继续分亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐继续分解放出解放出NO和和NO2。所以，可在临用前将亚硝酸钠放在。所以，可在临用前将亚硝酸钠放在pH4.5的醋酸缓冲液中，使先生成亚硝酸然后再使用。的醋酸缓冲液中，使先生成亚硝酸然后再使用。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育亚硝基胍亚硝基胍(NTG)是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺

37、陷型突变，是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到不经淘汰便可直接得到12%12%至至80%80%的营养缺陷型菌株，的营养缺陷型菌株，有超级诱变剂之称。有超级诱变剂之称。在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。因此用甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。通常在浓度为通常在浓度为30ug/ml30ug/ml、温度为、温度为2828CC和时间为和时间为60min60min的条件下进行处理，容易得到高产菌株的条件下进行处理，容易得到高产菌株 。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选

38、育 剂剂 量量确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。下降。目前的处理剂量已从以前采用的死亡率目前的处理剂量已从以前采用的死亡率90-99.9%降低到降低到70-80%，甚至更低的剂量，特别是对于经过一再诱变的高，甚至更低的剂量，特别是对于经过一再诱变的高产菌株。产菌株。剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个剂

39、量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形别核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大成较纯的变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生回复突变少，促使变异后菌株的稳定。损伤，产生回复突变少，促使变异后菌株的稳定。凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。剂量就是合适剂量。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 处处 理理 方方 法法单一诱变剂处理单一诱变剂处理复合处理复合处

40、理1）两种或多种诱变剂先后使用）两种或多种诱变剂先后使用2）同一诱变剂重复处理）同一诱变剂重复处理3）两种或多种诱变剂同时使用）两种或多种诱变剂同时使用发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 菌种 单独处理 诱变剂 突变率（%）复合处理 诱变剂 突变率（%）土曲霉紫外线X-射线21.319.7紫外线+X-射线42.8土曲霉氮芥（0.1%）紫外线不明显4.7氮芥+紫外线11.0链霉菌紫外线-射线31.035.0紫外线+-射线43.6金色链霉菌二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外线6.061.7812.5二乙烯三胺+紫外线硫酸二乙酯+紫外线26.635.9 诱变剂的复合处理及其协同效应诱

41、变剂的复合处理及其协同效应发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育4 4、诱变处理后的后培养、诱变处理后的后培养表型迟延现象表型迟延现象 生理性生理性 分离性分离性 遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复制才能表现出来。制才能表现出来。研究表明，诱变后的一小时内必须进行新的蛋研究表明，诱变后的一小时内必须进行新的蛋白质合成，这个变异才有效。白质合成，这个变异才有效。因此必须在完全培养基中进行培养才能稳定变因此必须在完全培养基中进行培养才能稳定变异，使菌株表现出高的突变频率。异，使菌株表现出高的突变频率。发酵工程发酵工程 第二章第二章

42、 微生物菌种选育微生物菌种选育A 不经液体后培养不经液体后培养 B 经液体后培养经液体后培养发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育5 5、变异菌株的筛选、变异菌株的筛选由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，所以必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的所以必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。菌株。初筛初筛 和和 复筛复筛发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大理效

43、应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大小来进行初步测定。小来进行初步测定。初初 筛筛 要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主要应着眼于尽量扩大挑选范围。要应着眼于尽量扩大挑选范围。例如，测定突变株淀粉酶活力，可把待测菌株的培养液例如，测定突变株淀粉酶活力，可把待测菌株的培养液以相同大小和条件浸泡的滤纸片点植于淀粉平板上，经以相同大小和条件浸泡的滤纸片点植于淀粉平板上，经培养后滴加碘液再仔细观察并测定其透明圈的大小。培养后滴加碘液再仔细观察并测定其透明圈的大小。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育 部分微生物菌株经过

44、诱变处理后，变异菌株的部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性，可在初筛时加以利用。关性，可在初筛时加以利用。赤霉素产生菌赤霉素产生菌 色素色素 暗红加深，产量上升暗红加深，产量上升红霉素产生菌红霉素产生菌 有颜色有颜色 产量下降产量下降灰黄霉素产生菌灰黄霉素产生菌野生菌株高产菌株碱性脂肪酶产生菌碱性脂肪酶产生菌野生菌株高产变异株发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育复复 筛筛 在初筛缩小了的范围中选出产量最高的在初筛缩小了的范围中选出产量最高的1-2个菌株，主个菌株，主要着眼于在接近

45、生产条件的情况下精确地测定出菌株的生要着眼于在接近生产条件的情况下精确地测定出菌株的生产性状。产性状。复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试。摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育设计或采用高效筛选方案或方法设计或采用高效筛选方案或方法一个出发菌株诱变剂处理选出200个单 孢子菌菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5 株第一轮第二轮五个出发菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5 株40株40株40株40株40株诱变

46、剂处理 经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各样的经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各样的变异，如营养缺陷、抗性突变、形态变异、生长变异，如营养缺陷、抗性突变、形态变异、生长温度变异等，这些变异均可用各种方法筛选出来。温度变异等，这些变异均可用各种方法筛选出来。几种重要突变株的筛选几种重要突变株的筛选发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育1 1、营养缺陷型菌株的筛选、营养缺陷型菌株的筛选 氨基酸、核苷酸生产菌株氨基酸、核苷酸生产菌株 等等 影印培养法、夹层培养法、逐个检出法等影印培养法、夹层培养法、逐个检出法等发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育2

47、2、抗性突变株的筛选、抗性突变株的筛选抗生素抗生素金属离子金属离子温度温度噬菌体噬菌体 提高某代谢产物的产量提高某代谢产物的产量如 抗氯霉素的解烃棒杆菌突变株比亲株产生的棒杆菌素高3倍。（氯霉素是棒杆菌素的结构类似物）又如，蜡状芽孢杆菌的抗利福平无芽孢突变株的又如，蜡状芽孢杆菌的抗利福平无芽孢突变株的-淀淀粉酶产量提高了粉酶产量提高了7倍。倍。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育3 3、温度敏感突变型筛选、温度敏感突变型筛选TS（Ts;ts）突变株）突变株（temperature-sensitive mutant）指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。指仅在

48、某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。在某个温度以上显示出和野生型不同表型。在某个温度以上显示出和野生型不同表型。低温敏感突变型：低温敏感突变型：在某个温度以下显示出与野生型不同表型。在某个温度以下显示出与野生型不同表型。如果发生这类突变的基因控制的特性是生长繁殖不可缺少如果发生这类突变的基因控制的特性是生长繁殖不可缺少 的，那么就会形成的，那么就会形成条件致死突变型条件致死突变型。温度敏感突变型温度敏感突变型（高温）（高温）是最常用的一类条件致死突变型是最常用的一类条件致死突变型 基因功能研究、育种基因功能研究、育种发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育许可温度许

49、可温度(permissive temperature)保持原来正常性状的温度保持原来正常性状的温度限制性温度限制性温度(restrictive temperature非许可温度非许可温度 (non-permissive temperature)显现突变型性状的温度显现突变型性状的温度TS突变株突变株 在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不同。同。发酵工程发酵工程 第二章第二章 微生物菌种选育微生物菌种选育原因原因:TSTS突变株突变株的一种重

50、要酶蛋白（例如的一种重要酶蛋白（例如 DNA DNA 聚合酶、氨基酸活聚合酶、氨基酸活化酶等）在某种温度下呈现活性，而在另一种温度下却是钝化化酶等）在某种温度下呈现活性，而在另一种温度下却是钝化的。的。原因是由于这些酶蛋白的肽链中更换了几个氨基酸，从而降原因是由于这些酶蛋白的肽链中更换了几个氨基酸，从而降低了原有的抗热性。低了原有的抗热性。TS突变株在代谢过程中的各个环节，如核酸合成、蛋白质合突变株在代谢过程中的各个环节，如核酸合成、蛋白质合成、细胞膜或细胞分裂过程中，某种酶的合成或功能由温度所成、细胞膜或细胞分裂过程中，某种酶的合成或功能由温度所控制控制例如，有些大肠杆菌菌株可生长在例如，有