微生物制药课件.ppt
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1、第二章第二章 微生物制药微生物制药一、微生物药物的几个相关基本概念一、微生物药物的几个相关基本概念二、微生物药物的分类二、微生物药物的分类三、微生物药物的应用三、微生物药物的应用四、药源微生物及微生物药物的筛选技术四、药源微生物及微生物药物的筛选技术五、微生物药物的发酵生产技术五、微生物药物的发酵生产技术六、微生物药物的分离、精制和鉴别六、微生物药物的分离、精制和鉴别七、废弃物的综合利用和环境保护七、废弃物的综合利用和环境保护四、药源微生物及微生物药物的筛选技术四、药源微生物及微生物药物的筛选技术(一)药物的产生菌(一)药物的产生菌(二)新药产生菌的分离(二)新药产生菌的分离(三)新微生物药物
2、的筛选(三)新微生物药物的筛选(四)微生物药物产生菌的菌种改良(四)微生物药物产生菌的菌种改良(五)微生物药物产生菌的保藏(五)微生物药物产生菌的保藏(三)新微生物药物的筛选(三)新微生物药物的筛选1、初筛发酵、初筛发酵初筛发酵是能否产生抗生素的关键,需要选择适合初筛发酵是能否产生抗生素的关键,需要选择适合的发酵培养基和培养条件,以利于抗生素的合成。的发酵培养基和培养条件,以利于抗生素的合成。培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料。培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料。培养基成分培养基成分碳源碳源糖类、脂肪、某些有机糖类、脂肪、某些有机酸、醇或碳氢化合物酸、醇或碳氢化合物供给微生
3、物生命活动所需要供给微生物生命活动所需要的能量以及构成菌体细胞成的能量以及构成菌体细胞成分和代谢产物。分和代谢产物。氮源氮源蛋白胨、黄豆饼粉、花蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、肉膏、生饼粉、玉米浆、肉膏、酒泥酒泥硫酸铵、氨水、硝酸盐硫酸铵、氨水、硝酸盐等等供给微生物生长所需的氮素,供给微生物生长所需的氮素,构成菌体原生质构成菌体原生质无机无机盐、盐、微量微量元素元素磷、镁、钾、钠等磷、镁、钾、钠等铁、铜、锌、锰、钴、铁、铜、锌、锰、钴、钼等钼等可以作为生理活性物质的组可以作为生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物成或生理活性作用的调节物初筛方式:初筛方式:固体平板发酵固体平板发酵液体振荡
4、培养液体振荡培养便于大量筛选抗菌物质时采用。便于大量筛选抗菌物质时采用。放线菌大都为好氧菌,增加溶解氧放线菌大都为好氧菌,增加溶解氧有利于放线菌生长和抗生素的合成。有利于放线菌生长和抗生素的合成。10000株新分离的放线菌株新分离的放线菌30株(可能是新抗生素)株(可能是新抗生素)10种新化合物种新化合物1种有希望的化合物,低毒性,体内有效种有希望的化合物,低毒性,体内有效新抗生素新抗生素/分离的菌株数:分离的菌株数:1/1000新抗生素新抗生素/已知抗生素:已知抗生素:1/50有希望的抗生素有希望的抗生素/分离的菌株数:分离的菌株数:1/100002500株对细菌有抗菌活性株对细菌有抗菌活性
5、500株株250株链丝菌素类株链丝菌素类125株链霉素类株链霉素类40株四环素类株四环素类55株其他已知抗生素株其他已知抗生素交叉耐药试验和纸层鉴别交叉耐药试验和纸层鉴别毒性试验毒性试验(1)常规的筛选方法)常规的筛选方法琼脂扩散法琼脂扩散法利用利用多种微生物多种微生物作为检定菌,作为检定菌,筛选有抗菌活性的物质。筛选有抗菌活性的物质。v非致病菌非致病菌v抗生素耐药突变株和超敏菌株抗生素耐药突变株和超敏菌株v厌氧菌厌氧菌v协同活性检测协同活性检测(2)定靶筛选)定靶筛选从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型,有目的地筛选具有某种机理来
6、设计筛选模型,有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素,试图获得抗菌作用强、对作用机理的抗生素,试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。耐药菌有效、毒性小的新抗生素。q以作用机理为依据的筛选方法以作用机理为依据的筛选方法q以耐药机制为依据的筛选方法以耐药机制为依据的筛选方法细菌细胞壁合成抑制剂的筛选细菌细胞壁合成抑制剂的筛选土壤分离的微生物(土壤分离的微生物(10200株)(细菌、真菌和放线菌)株)(细菌、真菌和放线菌)第二步:第二步:测定抑制同位素渗入测定抑制同位素渗入meso-3H二氨基庚二酸二氨基庚二酸L-14C亮氨酸亮氨酸用用Diaflo UM-2膜测定相膜测定相对分子质量(对
7、分子质量(1000以下)以下)小分子量:小分子量:azureomycin A和和B(新)(新)AM-1034AM-5289Amphomycin,青霉素,青霉素G大分子量:大分子量:ristocetin A 和和B其他(其他(11种)种)+-+-+(487)(238)(1530)+-+-+第一步:第一步:抗微生物活性:细菌抗微生物活性:细菌支原体支原体细胞壁合成抑制剂细胞壁合成抑制剂(141)asukamycinSetomimycinvineomycinsnanaomycinA、B、C、D、Efreonolicin Bcervinomycins其他其他q以耐药机制为依据的筛选方法以耐药机制为依据
8、的筛选方法抗生素的广泛使用和一些不合理的滥用,引起抗生素的广泛使用和一些不合理的滥用,引起细菌耐药性的增加,而细菌耐药机制的研究进细菌耐药性的增加,而细菌耐药机制的研究进展又使耐药性的解决成为可能。展又使耐药性的解决成为可能。细菌的耐药机制主要有细菌的耐药机制主要有4 4种:种:A.A.细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的抗生素,使之失去生物活性;进入细菌细胞内的抗生素,使之失去生物活性;B.B.抗生素的作用靶点由于发生突变或被细菌的某种酶抗生素的作用靶点由于发生突变或被细菌的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用,以及抗生素作用
9、修饰而使抗菌药物无法发挥作用,以及抗生素作用的靶酶的结构发生改变使之与抗生素的亲和力下降;的靶酶的结构发生改变使之与抗生素的亲和力下降;C.C.由于细菌细胞膜渗透性的改变或其他有关特性的改由于细菌细胞膜渗透性的改变或其他有关特性的改变;变;D.D.细菌具有一种依赖于能量的主动转运机制,它能够细菌具有一种依赖于能量的主动转运机制,它能够把进入胞内的药物泵至胞外。把进入胞内的药物泵至胞外。-内酰胺酶抑制剂的筛选内酰胺酶抑制剂的筛选-内酰胺酶内酰胺酶是一类能够破坏具有是一类能够破坏具有-内酰胺结构抗生素的内酰胺结构抗生素的钝化酶的总称。许多致病菌由于产生钝化酶的总称。许多致病菌由于产生-内酰胺酶而对
10、内酰胺酶而对青霉素和头孢菌素具有抗性。青霉素和头孢菌素具有抗性。-内酰胺酶抑制剂的筛选内酰胺酶抑制剂的筛选主要依据抑制剂抑制主要依据抑制剂抑制-内酰胺内酰胺酶,使酶失去活性,不能水解酶,使酶失去活性,不能水解-内酰胺类抗生素,使内酰胺类抗生素,使抗生素保持生物活性,从而抑制细菌生长繁殖。抗生素保持生物活性,从而抑制细菌生长繁殖。耐药菌株平板法耐药菌株平板法液体测定法液体测定法联合使用联合使用-内酰胺酶以及敏感和耐药突变株内酰胺酶以及敏感和耐药突变株通过颜色变化来检测通过颜色变化来检测-内酰胺酶抑制剂内酰胺酶抑制剂诱导诱导-内酰胺酶方法的应用内酰胺酶方法的应用高通量筛选(高通量筛选(high t
11、hroughput screening)技术是)技术是20世纪世纪80年年代后期形成的寻找新药的高新技术。代后期形成的寻找新药的高新技术。将许多模型固定在各自不同的载体上,用机器人加样,培养将许多模型固定在各自不同的载体上,用机器人加样,培养后用计算机记录结果,并进行分析,可以实现大规模的筛选。后用计算机记录结果,并进行分析,可以实现大规模的筛选。高通量筛选的模型:高通量筛选的模型:细胞模型细胞模型观察待测样品对细胞的作用,反映观察待测样品对细胞的作用,反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括各种正药物对细胞生长等过程的综合作用。包括各种正常细胞和病理细胞。常细胞和病理细胞。分子模型分子模型包
12、括受体、酶等,药物作用的靶点包括受体、酶等,药物作用的靶点明确。明确。其他模型其他模型四、药源微生物及微生物药物的筛选技术四、药源微生物及微生物药物的筛选技术(一)药物的产生菌(一)药物的产生菌(二)新药产生菌的分离(二)新药产生菌的分离(三)新微生物药物的筛选(三)新微生物药物的筛选(四)微生物药物产生菌的菌种改良(四)微生物药物产生菌的菌种改良(五)微生物药物产生菌的保藏(五)微生物药物产生菌的保藏 目的目的将产生菌的一些有益变异,通过不断将产生菌的一些有益变异,通过不断的筛选和培育,为研究和生产提供更多合乎需的筛选和培育,为研究和生产提供更多合乎需要的高产优质新菌种。要的高产优质新菌种。
13、(四)微生物药物产生菌的菌种改良(四)微生物药物产生菌的菌种改良1 1、自然选育、自然选育在生产过程中,不经过人工诱变处理,根据菌种的在生产过程中,不经过人工诱变处理,根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程,叫做自发突变而进行菌种筛选的过程,叫做自然选育或自然选育或自然分离。自然分离。自然选育包括自然选育包括v从自然界分离获得菌株从自然界分离获得菌株v根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。一般包括以下几个步骤:采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。一般包括以下几个步骤:采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。调查研究(包括资料查阅)调查研究(包括资料查阅)试
14、验方案设计试验方案设计采样采样第一次增殖培养第一次增殖培养第一次平板分离第一次平板分离第二次增殖培养第二次增殖培养第二次平板分离第二次平板分离第二次原种斜面第二次原种斜面初筛(初筛(1株株1瓶)瓶)增殖条件摸索增殖条件摸索第一次原种斜面第一次原种斜面第三次平板分离第三次平板分离第三次原种斜面第三次原种斜面复筛(复筛(1株株3-5瓶)瓶)第四次平板分离第四次平板分离第四次原种斜面第四次原种斜面再复筛再复筛较优化菌株较优化菌株1-3株株初步工艺条件摸索初步工艺条件摸索第三次原种保藏第三次原种保藏种子培养种子培养某些必要试验和毒性试验等某些必要试验和毒性试验等2 2)从自发突变体中获得菌株)从自发突
15、变体中获得菌株2 2、诱变选育、诱变选育人工诱变人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱,能提高突变频率和扩大变异谱,具有速度快、方法简便等优点,是当前菌种具有速度快、方法简便等优点,是当前菌种选育的一种主要方法,使用普遍。选育的一种主要方法,使用普遍。诱发突变随机性大,必须与大规模的筛选诱发突变随机性大,必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。工作相配合才能受到良好的效果。诱变育种的主要环节:诱变育种的主要环节:以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液(细胞或孢子)以引微生物细胞悬浮液(细胞或孢子)以引起绝大多数细胞致死的同时,使存活个起绝大多数
16、细胞致死的同时,使存活个体中体中DNADNA碱基变异频率大幅度提高;碱基变异频率大幅度提高;用合适的方法淘汰负效应变异株,选出用合适的方法淘汰负效应变异株,选出极少数性能优良的正变异株,以达到培极少数性能优良的正变异株,以达到培育优良菌株的目的。育优良菌株的目的。a.出发菌株的选择出发菌株的选择b.菌悬液的制备菌悬液的制备c.前培养前培养d.诱变诱变e.变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选1)诱变剂)诱变剂物理诱变剂物理诱变剂化学诱变剂化学诱变剂生物诱变剂生物诱变剂各种射线,如紫外线、各种射线,如紫外线、X射线、射线、射线、射线、射线、射线、射线和超射线和超声波等声波等乙基磺酸乙酯(乙基磺
17、酸乙酯(EMS)、亚硝基胍、)、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。亚硝酸、氮芥等。噬菌体、转座因子噬菌体、转座因子防护面罩防护衣防护罩各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间诱变剂诱变剂诱变剂的剂量诱变剂的剂量处理时间处理时间缓冲剂缓冲剂中止反应方法中止反应方法亚硝酸(亚硝酸(HNO2)0.010.1mol/L510minpH值值4.5,1mol/L醋醋酸缓冲液酸缓冲液pH8.6,0.07磷酸二氢钠磷酸二氢钠硫酸二乙酯硫酸二乙酯(DES)0.511030min,孢子孢子1824hpH值值7.0,0.1mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释甲基
18、磺酸乙酯甲基磺酸乙酯(EMS)0.050.5mol/L1060min,孢子孢子36hpH值值7.0,0.1mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释亚硝基胍(亚硝基胍(NTG)0.11.0 mol/mL,孢子孢子3mg/mL1560min,90120minpH值值7.0,0.1mol/L磷酸缓冲液或磷酸缓冲液或Tris缓缓冲液冲液大量稀释大量稀释亚硝基甲基胍亚硝基甲基胍(NMU)0.11.0 mol/mL1590minpH值值6.07.0,0.1mol/L磷酸缓冲剂磷酸缓冲剂或或Tris缓冲液缓冲液大量稀释大量稀释氮芥氮芥0.11.0 mol/mL510minNaH
19、CO3甘氨酸或大量甘氨酸或大量稀释稀释乙烯亚胺乙烯亚胺1:10001:100003060min硫代硫酸钠或硫代硫酸钠或大量稀释大量稀释羟胺羟胺(NH2OHHCl)0.10.5数小时或生长过程数小时或生长过程中诱变中诱变大量稀释大量稀释氯化锂(氯化锂(LiCl)0.30.5加入培养基中,在加入培养基中,在生长过程中诱变生长过程中诱变大量稀释大量稀释秋水仙碱秋水仙碱(C22H25NO6)0.010.2加入培养基中,在加入培养基中,在生长过程中诱变生长过程中诱变大量稀释大量稀释2)影响诱变效果的因素)影响诱变效果的因素出发菌株的遗传特性;出发菌株的遗传特性;诱变剂;诱变剂;菌种的生理状态;菌种的生理
20、状态;被处理菌株的预培养和后培养条件;被处理菌株的预培养和后培养条件;诱变处理时的外界条件等。诱变处理时的外界条件等。a)选择合适的出发菌株选择合适的出发菌株b)采用分散状态的孢子悬浮液处理采用分散状态的孢子悬浮液处理c)采用单核细胞(或核质体)处理采用单核细胞(或核质体)处理d)注意微生物的生理状态注意微生物的生理状态e)适宜的诱变剂量适宜的诱变剂量3 3)筛选的方法)筛选的方法出发菌种(砂土管或冷冻管)出发菌种(砂土管或冷冻管)斜面斜面或肉汤培养或肉汤培养24 h单孢子悬液单孢子悬液 诱变处理诱变处理稀释涂布平板稀释涂布平板挑取单菌落传种斜面挑取单菌落传种斜面菌悬液菌悬液观察单菌落形态并统
21、计其形态变异率观察单菌落形态并统计其形态变异率摇瓶初筛摇瓶初筛挑出高产斜面挑出高产斜面菌种保藏(砂土管、冻干管或制备固体孢子)菌种保藏(砂土管、冻干管或制备固体孢子)摇瓶复筛(复筛次数及摇瓶数以及培养基种类根据情况决定)摇瓶复筛(复筛次数及摇瓶数以及培养基种类根据情况决定)挑出高产菌株挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察作稳定性试验和菌种特性考察放大试验罐、中试考察放大试验罐、中试考察大型投产试验大型投产试验对照组对照组对照组对照组一般经诱变后,再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。一般经诱变后,再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。淘汰野生型菌株的方法有
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