微生物102、3第十章微生物的遗传变异和育种课件.ppt

1、第十章第十章 微生物的遗微生物的遗传变异和育种传变异和育种 第二节第二节 基因突变与基因突变与自然选育自然选育v突变是工业微生物产生变种的根源，是育种的基础，突变是工业微生物产生变种的根源，是育种的基础，但也是菌种发生退化的主要原因。但也是菌种发生退化的主要原因。v突变突变泛指微生物细胞内遗传物质的结构或数量突然泛指微生物细胞内遗传物质的结构或数量突然发生的可遗传的变化。发生的可遗传的变化。v基因突变的特点：自发性、不对应性、稀有性、独基因突变的特点：自发性、不对应性、稀有性、独立性、可诱变性、稳定性、可逆性。立性、可诱变性、稳定性、可逆性。一、突变1.突变包含狭义狭义的突变和广义广义的突变。

2、v狭义的突变专指基因突变，也称点突变，涉及一对或少数几对核苷酸的增加、减少或取代。同义突变：同义突变：突变后密码子编码的仍是同一种氨基酸；错义突变：错义突变：编码另外一种氨基酸；无义突变：无义突变：突变后为终止密码；移码突变：移码突变：突变点后遗传密码的阅读框架发生移动。v广义的突变包括基因突变基因突变和染色体畸变染色体畸变。染色体畸变染色体畸变指的是染色体结构的改变，包括缺失、重复、倒位和易位等。2.突变包含自发突变和诱发突变。v自发突变自发突变是在没有采用诱变手段下野生菌群体中自然发生的突变体。v诱发突变诱发突变是采用物理或化学手段(即诱变剂)，处理后得到的突变体。v自发突变和诱变本质上是

3、相同的，都是以一定的概率产生的。1.自然选育的概念自然选育的概念v自然选育：自然选育：在生产过程中，不经过人工在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的处理，利用菌种的自然突变自然突变(Spontaneous Mutation)而进行的菌种筛选过程，又叫而进行的菌种筛选过程，又叫自然分离。自然分离。二、自然选育二、自然选育自然突变的原因：自然突变的原因：（1）多因素低剂量的诱变效应）多因素低剂量的诱变效应v由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如充斥空间的各种短波辐射、自然综合效应，如充斥空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的低浓度诱变物质、微

4、生物自身界中普遍存在的低浓度诱变物质、微生物自身代谢产生的诱变物质如代谢产生的诱变物质如H2O2等的作用。等的作用。（2）互变异构效应）互变异构效应v胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)(T)和鸟嘌呤和鸟嘌呤(G)(G)的第六位上可以的第六位上可以酮式或酮式或烯醇式烯醇式出现，胞嘧啶出现，胞嘧啶(C)(C)和腺嘌呤和腺嘌呤(A)(A)第六位可以第六位可以氨基式或亚氨基式氨基式或亚氨基式出现，平衡一般倾向于出现，平衡一般倾向于酮式和酮式和氨基式氨基式，但在偶然情况下，会出现稀有的烯醇式，但在偶然情况下，会出现稀有的烯醇式和亚氨基式，使和亚氨基式，使DNADNA双链结构中常出现的双链结构中常出现的ATAT和和G

5、CGC碱基对变成碱基对变成GTGT和和ACAC，发生突变，几率约为，发生突变，几率约为1010-8-81010-9-9。NNNNOHH2NHNNNNOHH2NH123456789鸟嘌呤(Guanine)Keto formEnol formNNNHOHHNNNH2OH321654胞嘧啶(Cytosine)Imino formAmino formNNNNNH2HNNOOHHCH3腺嘌呤(Adenine)NNOOHH胸腺嘧啶(Thymine)尿嘧啶(Uracil)2.2.自然选育的目的自然选育的目的v发酵工业使用的发酵工业使用的生产菌株生产菌株，几乎都是经过人工，几乎都是经过人工诱变处理后获得突变株

6、，遗传特性往往不够稳诱变处理后获得突变株，遗传特性往往不够稳定，定，容易继续发生变异容易继续发生变异，变异的方向一个是菌，变异的方向一个是菌种衰退，造成发酵产量的降低，另一个是菌种种衰退，造成发酵产量的降低，另一个是菌种变异获得优良性状，使发酵产量提高。经常进变异获得优良性状，使发酵产量提高。经常进行行自然选育工作，可以淘汰衰退的菌株，保存自然选育工作，可以淘汰衰退的菌株，保存优良的菌株，稳定和提高发酵产量优良的菌株，稳定和提高发酵产量。3.3.自然选育的一般程序：自然选育的一般程序：采用单菌落分离法采用单菌落分离法v单细胞或单孢子悬浮液要求有良好的分散度：单细胞或单孢子悬浮液要求有良好的分散

7、度：v细菌应转种到新鲜肉汤液体中培养，取得分散的菌体细菌应转种到新鲜肉汤液体中培养，取得分散的菌体v放线菌或霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振荡打散孢放线菌或霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振荡打散孢子后在过滤子后在过滤,对粘性大的孢子，可以加入对粘性大的孢子，可以加入0.05%的分散剂的分散剂(如如Tween 80，一种非离子活性剂一种非离子活性剂)菌种单孢子或单细胞悬浮液稀释固体平板分离部分单菌落生产能力测定反复筛选优良菌株留种保藏4.4.自然选育的特点自然选育的特点v简单易行；简单易行；v效率低、进展慢、难以使生产水平大幅效率低、进展慢、难以使生产水平大幅度提高，需要与诱变育种结合交替使用。

8、度提高，需要与诱变育种结合交替使用。第三节 突变的诱发与微生物诱变育种 v微生物育种过程分为：菌种基因型改变筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型的变异株产量评估，全面考察变异株在工业化生产上的接受性。一、突变诱发过程一、突变诱发过程v从诱变剂进入细胞到突变型出现的整个从诱变剂进入细胞到突变型出现的整个过程都会有一些因素过程都会有一些因素影响突变的诱发影响突变的诱发。1 诱变剂接触诱变剂接触DNA分子前分子前诱变剂DNA细胞的透性细胞质某些组分和酶是否处于复制或转录状态突变的诱发2 DNA损伤的修复损伤的修复v五种修复方式五种修复方式：光复活作用；切补修复；光复活作用；切补修复；重组修复；

9、重组修复；SOS修复系统；修复系统；DNA多聚酶多聚酶的校正作用。的校正作用。（D）SOS修复系统修复系统v这是一种能够造成误差修复的这是一种能够造成误差修复的“呼救信呼救信号号”修复系统。当修复系统。当DNA受到诱变剂损伤受到诱变剂损伤而阻断而阻断DNA复制过程时，复制过程时，DNA损伤相当损伤相当于一个呼救信号，促使细胞中的有关酶于一个呼救信号，促使细胞中的有关酶系解除阻遏，而进行系解除阻遏，而进行DNA的修复。的修复。在修在修复过程中，复过程中，DNA多聚酶多聚酶在无模板的情况在无模板的情况下下进行进行DNA的修复的修复（E）DNA多聚酶的校正作用多聚酶的校正作用v除了上述种种修复作用以

10、外，细胞还具有对复制过程中出除了上述种种修复作用以外，细胞还具有对复制过程中出现的差错加以校正的功能。大肠杆菌中的现的差错加以校正的功能。大肠杆菌中的DNA复制依赖于复制依赖于三种三种DNA多聚酶的作用，多聚酶的作用，这三种酶除了对于多核苷酸的多这三种酶除了对于多核苷酸的多聚作用以外，还具有聚作用以外，还具有3到到5核酸外切酶的作用。核酸外切酶的作用。一般认为一般认为依靠依靠DNA多聚酶的这一作用，多聚酶的这一作用，能在复制过程中随时切除不能在复制过程中随时切除不正常的核苷酸。正常的核苷酸。如果如果DNA多聚酶发生突变而使其核酸外切多聚酶发生突变而使其核酸外切酶活性减弱，那么它切除不正常核苷酸

11、的能力减弱，菌体酶活性减弱，那么它切除不正常核苷酸的能力减弱，菌体的突变率相应地提高，成为的突变率相应地提高，成为增变突变型增变突变型，DNA多聚酶为多聚酶为DNA修复作用所必需，所以增变突变型对于诱变剂的作用修复作用所必需，所以增变突变型对于诱变剂的作用格外敏感。格外敏感。3 从前突变到突变从前突变到突变v诱变剂造成的诱变剂造成的DNA分子的某一位置的结构改变分子的某一位置的结构改变称为称为前突变前突变。前突变可以通过影响。前突变可以通过影响DNA复制而复制而成为成为真正的突变真正的突变，也可以经过修复，也可以经过修复不发生突变。不发生突变。v一般认为一般认为光复活作用、切补修复和光复活作用

12、、切补修复和DNA多聚酶多聚酶的校正作用具有校正功能而不利于突变的校正作用具有校正功能而不利于突变的诱发，的诱发，而而重组修复和重组修复和SOS修复系统具有引起差错的性修复系统具有引起差错的性质而有利于突变质而有利于突变的发生。的发生。v一切影响一切影响DNA修复系统中酶活性以及与突变相修复系统中酶活性以及与突变相关的酶活性的因素都能影响由关的酶活性的因素都能影响由前突变向突变的前突变向突变的转变。转变。v例如：咖啡碱能抑制切补修复系统，从而增强例如：咖啡碱能抑制切补修复系统，从而增强诱变作用；诱变作用；SOS修复系统和重组修复依赖于蛋修复系统和重组修复依赖于蛋白质合成，因而利于蛋白质合成的因

13、素有利于白质合成，因而利于蛋白质合成的因素有利于提高突变率；提高突变率；Ba2+（钡）钡）通过对通过对DNA多聚酶的多聚酶的3核酸外切酶活性的抑制提高突变率。核酸外切酶活性的抑制提高突变率。4 从突变到突变型从突变到突变型v表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型表型延迟延迟。分离性延迟和生理性延迟分离性延迟和生理性延迟分离性延迟：分离性延迟：v经诱变后，细胞中野生型基因和突变型基因并经诱变后，细胞中野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中，突变型基因由于存于同一细胞中，突变型基因由于属于隐性基属于隐性基因而没有表达因而没有表达，需要经过复制、分离，在细胞，需

14、要经过复制、分离，在细胞中只有突变型基因，没有野生型基因时，其性中只有突变型基因，没有野生型基因时，其性状才得到表达。状才得到表达。生理性延迟：生理性延迟：v在突变基因已经为纯的状态后，突变表型在突变基因已经为纯的状态后，突变表型还不一定出现，必须等到还不一定出现，必须等到原有基因的产物原有基因的产物稀释到某一程度才表现出来，稀释到某一程度才表现出来，而这些原有而这些原有基因产物的浓度降低到能改变表型的临界基因产物的浓度降低到能改变表型的临界水平前，细胞已经分裂多次，经过多个世水平前，细胞已经分裂多次，经过多个世代。（如噬菌体菌株的表达会出现）代。（如噬菌体菌株的表达会出现）v诱变育种包括诱变

15、育种包括三个环节三个环节：突变的诱发、突变的诱发、突变株的筛选、突变高产基因的表现突变株的筛选、突变高产基因的表现，根据这三个环节进行方案设计。根据这三个环节进行方案设计。制定筛选目标制定筛选目标v对于随机对于随机出现的多种变异性状，筛选的目标除了出现的多种变异性状，筛选的目标除了要求高产量之外，还应从生产的角度考虑其它要求高产量之外，还应从生产的角度考虑其它有有利性状利性状如：如：生长速度快、产孢子多；消除某些色生长速度快、产孢子多；消除某些色素或无益组分等。素或无益组分等。v但是所定的筛选目标不可太多。但是所定的筛选目标不可太多。工作量大，考虑实现目标的可能性。工作量大，考虑实现目标的可能

16、性。包括：出发菌株的选择，菌悬液的制备，诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的处理方式方法，纯化分离等。（一）出发菌株v出发菌株的选择是决定诱变效果的重要环节。v对菌种的遗传背景、稳定性、纯一性以及形态、生遗传背景、稳定性、纯一性以及形态、生理、生化等特性研究理、生化等特性研究，都有利于提高诱变效果。2 出发菌株的纯化v确定诱变出发菌株之后，就要进行纯化。v纯种分离方法，常用和。v采用显微操纵仪分离单个孢子，培养形成单菌落，这样可以得到完全真实的纯菌株。稀释平板分离法稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。：倾注平板法和涂布平板法。基本过程：（基本过程：（1）梯度稀释过程；（）梯度稀释过程；（2）分离

17、培养过程）分离培养过程涂布涂布倾注倾注梯梯 度度 稀稀 释释 过过 程程10-110-210-310-410-510-6（二）单孢子悬浮液的制备v供试细胞在生理活性方面既要同步，又要处在最旺盛的对数期。v菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子。v生理盐水或缓冲液配制。（三）诱变剂其他诱变剂其他诱变剂诱变剂诱变剂物理因素物理因素化学因素化学因素紫外线紫外线激光激光离子束离子束X射线射线r射线射线快中子快中子与碱基反应的物质与碱基反应的物质碱基类似物碱基类似物改变改变DNA结构的物质结构的物质烷化剂烷化剂亚硝酸类亚硝酸类吖啶吖啶类类“生物化学统一性生物化学统一性”法则：法则：人和细菌在人和细菌在D

18、NA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。最后造成癌变或其他不良的后果。诱变剂的共性原则：诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比超过超过95%95%的致癌物质对微生物有诱变作用的致癌物质对微生物有诱变作用90%90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用 （四）影响突变率的因素a.菌种的生理状态与诱变效果有密切关系菌种的生理

19、状态与诱变效果有密切关系b.诱变前后的培养条件对诱变效果有明显影响诱变前后的培养条件对诱变效果有明显影响c.其他外界条件其他外界条件如温度、氧气、如温度、氧气、pH、可见光等、可见光等对诱变也有影响对诱变也有影响（五）突变株的筛选（五）突变株的筛选v菌体细胞经诱变处理后，要从大量的变异菌株中，把菌体细胞经诱变处理后，要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来，需要明确的筛一些具有优良性状的突变株挑选出来，需要明确的筛选目标和筛选方法。选目标和筛选方法。育种工作中常用随机筛选和理性育种工作中常用随机筛选和理性筛选这两种方法。筛选这两种方法。1 随机筛选随机筛选v随机筛选即菌种经诱变

20、处理后，进行平板分离，随机随机筛选即菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选菌落，从中筛选出高产菌株。挑选菌落，从中筛选出高产菌株。a.摇瓶筛选法摇瓶筛选法b.琼脂块筛选法琼脂块筛选法c.筛选自动化和筛选工具微型化。筛选自动化和筛选工具微型化。2 理性化筛选理性化筛选v由于诱变后出现正突变株的几率小，用随机筛由于诱变后出现正突变株的几率小，用随机筛选的方法要耗费大量的人力物力，因而筛选方选的方法要耗费大量的人力物力，因而筛选方法逐渐转向理性化筛选。法逐渐转向理性化筛选。v理性化筛选：理性化筛选：运用遗传学、生物化学的原理，运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的根据产物已知的或可能的

21、生物合成途径、代谢生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构调控机制和产物分子结构来进行设计和采用的来进行设计和采用的一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高突变菌株。机制，获得能大量形成产物的高突变菌株。2.1 初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物高产菌株的筛选a.降低终产物浓度降低终产物浓度v筛选终产物营养缺陷型；筛选细胞膜透性筛选终产物营养缺陷型；筛选细胞膜透性改变的突变株；改变的突变株；b.筛选抗反馈突变菌株筛选抗反馈突变菌株v筛选结构类似物筛选结构类似物(抗代谢物抗代谢物)抗性突变株；抗性突变株；2.2次级代谢产物高

22、产菌株的筛选次级代谢产物高产菌株的筛选(主要是抗生素主要是抗生素)a.利用营养缺陷型筛选利用营养缺陷型筛选 b.筛选负变株的回复突变株筛选负变株的回复突变株 c.筛选去磷酸盐调节突变株筛选去磷酸盐调节突变株 d.筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株 e.筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 f.筛选二价金属离子抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株 g.筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 h.筛选自身所产的抗生素抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株2.3 根据菌株其它生理特性的筛选根据菌株其它生理特性的筛选v用于菌

23、株理性化筛选的除了代谢产物高产菌株用于菌株理性化筛选的除了代谢产物高产菌株的筛选，根据制定的筛选目标，还有其它类型的筛选，根据制定的筛选目标，还有其它类型的突变株，包括组成性突变株、的突变株，包括组成性突变株、消除无益组分消除无益组分的突变株、能有效利用廉价的发酵原材料的突的突变株、能有效利用廉价的发酵原材料的突变株、变株、细胞形态改变利于分离提取工艺的突变细胞形态改变利于分离提取工艺的突变株、株、抗噬菌体突变株抗噬菌体突变株等等。这些筛选目标虽然等等。这些筛选目标虽然不直接以产量为目标，但它们所具备的优良特不直接以产量为目标，但它们所具备的优良特性往往能导致产量的提高。性往往能导致产量的提高

24、。营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法诱变诱变检出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）（菌丝过滤法）（菌丝过滤法）夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法逐个检出法逐个检出法影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法（六）菌种特性研究 高产菌株选育之后，为了推广到大生产中去，需要研究菌种的纯度、遗传稳定性、菌落类型、群体的形态、生活能力、产孢子多少，保藏培养基及保藏方法；研究菌种碳、氮源利用情况、菌丝生长速度、菌丝量、发酵液粘度、过滤难易状况；还要注意考察菌种抗生素的组分变化，色素等其他质量问题；还要研究最适移种期、移种量、通气搅拌、温度、pH等等。对于这些重要发酵条件，一般在小型发酵罐和发酵罐之间摸索其间的相关性，为工业化生产提供更为接近的发酵条件。