第四章-免疫球蛋白课件.ppt

1、第四章第四章 免疫球蛋白免疫球蛋白抗体抗体（Antibody,Ab)是由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类能与相应抗原特异性结合，具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig)：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。分泌型：存在于体液中，具有抗体的各种功能 膜型：B细胞膜上的抗原受体 Ab=Ig,IgAb；Ab是功能描述，Ig是化学结构描述；第一节第一节 基本概念基本概念第二节第二节 免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构一一 、IgIg的基本结构的基本结构（一）、重链和轻链（一）、重链和轻链 IgM IgG IgA IgD IgE （二）可变区和恒定

2、区（二）可变区和恒定区 .可变区：可变区：重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，称为可变区（variable region,V区）；VH和和VL。2.恒定区恒定区：靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，称为恒定区(constant region,C区)；CH（CH1、CH2、CH3和CH4）和CL.高变区（高变区（hypervariable region，HVR）：）：氨基酸组成和排列顺序特别易变化 VH或VL各3个高变区：HVR1、HVR2和HVR3 骨架区（骨架区（framework region,FR）高变区之外的区域。VH和VL各有四个骨架区，FR1、FR2、FR3和FR4表

3、示。互补性决定区互补性决定区（complementarity-determining region，CDRCDR）：VH和VL的3个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，故高变区又被称为互补性决定区。（三）免疫球蛋白的功能区（三）免疫球蛋白的功能区1定义：Ig的H链、L链每隔110110个氨基酸个氨基酸由链内二硫键接构成一个能行使特定功能的球形结构，称为Ig的功能区。L链功能区：2个，（VL，CL各一个）H链功能区：IgG，IgA，IgD，4个（V区1个，C区3个）,IgM，IgE，5个（V区1个，C区4个）铰链区：位于CH1、CH2之间。铰链区：铰链区：赋予弹性赋予弹性和伸展性和伸展性.二、二、

4、IgIg的其他结构的其他结构（一）连接链（J链）：富含半胱氨酸得多肽链 由浆细胞合成的一种糖蛋白。IgA和IgM含有J链 可稳定Ig多聚体的成份（二）分泌片 是分泌型IgA(sIgA）的一个辅助成分，为一种糖肽，由粘膜上皮细胞合成和分泌。介导IgA二聚体的转运 保护sIgA的铰链区免受蛋白酶的水解破坏 J 链链分泌片分泌片sIgA三 Ig的酶解片断1.木瓜蛋白酶 2个FabFab 段：结合抗原 1个FcFc段：结合细胞2.胃蛋白酶F(ab)段:双价抗体活性pFc段：无生物学活性第三节免疫球蛋白的生物学活性第三节免疫球蛋白的生物学活性 11.1.特异性结合抗原特异性结合抗原,清除病原微生物清除病

5、原微生物 ；2.2.激活补体（激活补体（IgGIgG、IgMIgM）；）；3 3与多种细胞表面与多种细胞表面FcFc受体结合；受体结合；（1）调理作用（opsonization)：IgG、IgM 指抗体促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用。（2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)：IgG、IgA、IgE 指表达Fc受体的细胞（NK细胞、吞噬细胞)通过与抗体Fc段结合直接杀伤被抗体包被的靶细胞。（3）I型超敏反应：IgE 与肥大细胞、嗜碱性粒细胞Fc受体结合，促使其合成和释放生物活性物质。四、穿

6、过胎盘四、穿过胎盘 IgG所独有，是婴儿获得天然被动免疫的主要所独有，是婴儿获得天然被动免疫的主要原因，主要借助胎盘滋养层细胞表面的原因，主要借助胎盘滋养层细胞表面的Fc R进行进行的。的。五、免疫调节五、免疫调节 第三节第三节 五类五类IgIg的主要特性的主要特性 一、IgG（一）特性1、存在形式：单体，占血清Ig总量的3/4。2、合成时期：婴儿出生后三个月开始合成。3、半衰期：23天，是所有抗体中半衰期最长的。（二）生物活性1、是主要的抗感染抗体 2、是补体经典激活途径参与者。3、是唯一可以穿过胎盘的抗体4、具有调理作用和介导ADCC效应的功能。二、二、IgM（一）特性1、存在形式：五聚体

7、，占血清Ig总量的10%，是分子量最大分子量最大抗体。mIgM 是是 BCR 2、合成时期：胎儿晚期已能合成，最早合成和初次免疫应答中最早出现的抗体。3、半衰期：5天，（三）生物活性1、具有强大的调理、激活补体及杀菌作用。3、不能介导ADCC效应。4、ABO血型天然抗体。三、三、IgA（一）特性：1、存在形式：单体（血清型）和双体（分泌型）；其中分泌型分泌型主要分布于呼吸道、消化道及初乳等分泌液中。2、合成时期：婴儿在出生46个月才能合成IgA。（二）生物活性1、是机体局部粘膜防御感染局部粘膜防御感染的重要因素（分泌型IgA）。2、具有中和毒素作用（血清型IgA）。3、辅助婴儿抵抗呼吸道、消化

8、道感染（初乳中含分泌型IgA）四、四、IgDIgD（一）特性1、存在形式：单聚体，仅占血清Ig总量的1%。2、合成时期：较晚。3.半衰期：3天（二）生物活性1、成熟B细胞的重要表面标志。2、血清中IgD的功能尚不清楚。五、五、IgEIgE（一）特性1、存在形式：单聚体，仅占血清Ig总量的0.002%。2、合成时期：最晚合成的抗体。（三）生物活性1、引发型过敏反应型过敏反应。2、抗寄生虫的主要抗体。第四节第四节IgIg的基因及抗体的多样性的基因及抗体的多样性一、Ig的基因结构 1.Ig轻链基因结构（1）Ig 型轻链基因：V、J、C 小鼠：350 5 1 人：100 5 1（2）Ig型轻链基因：V

9、、J、C 小鼠：2 4 4 人：2 6 62.Ig重链的基因结构 V、D、J、C小鼠：300-1000 20 4 8 人：75-250 30 6 11 二、Ig基因重排 由于Ig基因成簇存在，编码完整的功能性Ig多肽链必须通过基因重排。轻链基因的重排、轻链基因的重排、RNARNA处理处理和蛋白质表达的过程和蛋白质表达的过程(二)抗体多样性机制:1.组合多样性：Ig基因库中众多V、D、J、C基因家族成员极端多样性的排列组合；2.连接多样性：基因重排过程中可出现不同的连接点；3.体细胞突变：已成熟的B细胞受抗原刺激后，在发育过程中重排基因所发生的突变。4.L链H链相互随机配对。多肽链基因片段数V区

10、基因重组方式重排和随机配对后推算的多样性数目V D JH链1000 12 4V-D-J48000链250-4V-J1000小鼠Ig多样性（举例）第五节第五节 抗体的应用抗体的应用免疫学检测免疫学检测 免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检测方法。具有很高的灵敏度和能快速提供检测结果等优点。抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点 特异性 抗原抗体反应的可见性 适当的比例和浓度 可逆性1、利用已知抗原检测未知抗体、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病：伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。（2）检测自身抗体诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等。2、利用已知抗

11、体检测未知抗原、利用已知抗体检测未知抗原（1）鉴定病原菌：诊断疾病（2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原;抗原或抗体的检测方法抗原或抗体的检测方法 凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应免疫标记技术免疫标记技术一）凝集反应（一）凝集反应（agglutinationagglutination）细菌的鉴定和血型的检查细菌的鉴定和血型的检查一、一、传统免疫分析传统免疫分析检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体2、双向免疫扩散（、双向免疫扩散（doule immunodiffusi

12、on）：）：抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。性分析。1 1）简易免疫电泳）简易免疫电泳先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线，2 2）对流免疫电泳）对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis,CIEP)是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术3 3）火箭免疫电泳）火箭免疫电泳

13、(rocket immunoelectrophoresis)(rocket immunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。可定量分析。用用标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性疫学诊断的敏感性1抗体制备。抗体制备。多克隆抗体 单克隆抗体，2 2标记物与标记方法。标记物与标记方法。放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统。免疫分析基本环节免疫分析基本环节 3分析方式设计：分析方式设计：非竞争方式、竞争方式；直接法、间接法；标记抗原、标记抗体；均相、非

14、均相4.4.信号检测。信号检测。与相应的标记物对应。主要为分光光度法、荧光光度法、化学发光检测法。利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术。特点：灵敏度高、特异性强、样品用量少灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备以及放射性强度容易检测1.放射免疫分析必需的基本试剂：放射免疫分析必需的基本试剂：抗体：抗体：作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白。标记药物：标记药物：提供可检测的信号(响应值)（放射性）。非标记药物：非标记药物：在标准曲线制备时是药物标准品，在样品中则为被测药物 分离剂分离剂分离结合与游离部分结合相游离相标记药物(S*)+抗体(Ab)标记药物

15、-抗体复合物(S*-Ab)F*P-B*B*F*、B*分别是游离的和与抗体结合的标记药物浓度，它们可通过产生的信号(如放射性、光吸收、荧光发射)强度反映出来(用仪器检测)。非标记药物（S）F +标记药物(S*)+抗体(Ab)标记药物-抗体复合物(S*-Ab)F*P-B-B*B*非标记药物-抗体复合物(S-Ab)B 随着S的加入，它对S*同Ab的结合则起竞争抑制作用，表现为使B*减少、使F*增加，并且只要S加入一定量，便有对应的F*和B*信号强度值，因此可建立S量(浓度)与响应值(F*和B*的信号强度)之间的函数关系，作成剂量反应曲线。免疫分析中各种竞争结合抑制曲线示意图3.3.标准曲线的绘制与样

16、品测定步骤标准曲线的绘制与样品测定步骤1.取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成58个系列浓度。2.加入定量标记抗原，其总放射性(T)应能满足准确测量的需要。3.加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度的要求。4.将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，待反应平衡后测定总计数率(T)。5.5.加入分离剂，加入分离剂，使结合部分使结合部分(B)(B)与游离部分与游离部分(F)(F)分离。分离。6.6.测定各管测定各管结合部分或游离部分的计数率结合部分或游离部分的计数率。7.7.标准曲线通常以标准抗原标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品待测药物标准品)

17、的浓度的浓度为横坐标，以结合率为横坐标，以结合率(B(B)为纵坐标作图。为纵坐标作图。纵坐标纵坐标B B的计算：将与抗体结合的标记药物的的计算：将与抗体结合的标记药物的放射性强度放射性强度(B)(B)与加入的标记药物总放射性强度与加入的标记药物总放射性强度(T)(T)比较，即比较，即B B=(B=(BT)T)100100；（二）酶免疫分析（二）酶免疫分析（enzyme immunoassay）标记物为酶标记物为酶，酶本身并不能直接产生信号，必须要有其他试剂如底物、辅酶等的参与才能完成酶反应，从而引起吸收光谱等的变化供测定。常用的酶为：常用的酶为：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、6-磷酸葡萄糖脱氢

18、酶、-半乳糖苷酶。酶酶 底底 物物显色反应显色反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,22,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基-并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄

19、糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405420-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光荧光黄色黄色 360,450420 1.均相酶免疫分析，均相酶免疫分析，EMITEMIT法法（enzyme multipled immunoassay technique）基本原理：基本原理：酶标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体(Ab)，测定小分子抗原。酶标抗原(AgE)同抗体(Ab)结合后，所形成的酶标抗原一抗体结合物(AgEAb)可使酶的活性发生改变(增强或减弱)；可

20、直接通过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法。2.2.酶联吸附免疫分析酶联吸附免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）属于非均相免疫分析的代表，普遍应用于各领普遍应用于各领域。域。基本原理：是将过量抗体（抗原）包被抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）酶标记抗体（抗原）也结合在载体上也结合在载体上，经洗涤洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。1 1）双抗体夹心法）双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检样品，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价

21、以上的较大分子抗原测定 如乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合

22、物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进行该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定2 2）间接法）间接法方法：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相上抗原结合的受检抗体应用：常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体123 3）竞争法）竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）EL

23、ISA试剂盒试剂盒（三）胶体金免疫快速检测法（三）胶体金免疫快速检测法1.双抗体夹心法双抗体夹心法-大分子抗原大分子抗原 样本加到样本加到S S区，进入区，进入B B区和区和B B区的金标抗体发生免疫反应，再层析到区的金标抗体发生免疫反应，再层析到T T线位置时，如果样本中含有待测抗原，则线位置时，如果样本中含有待测抗原，则T T线不显色或显色很淡，线不显色或显色很淡，C C线显色，线显色，这样得到的是这样得到的是阳性阳性结果。当待测样本中不含抗原时，再层结果。当待测样本中不含抗原时，再层析到析到T T线位置时，则线位置时，则T T线显色，线显色，C C线也显色线也显色，得到，得到阴性阴性结果

24、结果SBTCD2.2.竞争抑制法竞争抑制法 （四）免疫印迹法（四）免疫印迹法第五节第五节 抗体生成技术抗体生成技术传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体混合混合1 234BALB/c12341 234制备过程制备过程 通过B细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.癌细胞可培养生长浆细胞B cell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组两组染色体混在一起染色体混在一起也可以培也可以培养养生長生長产产生生专专一性抗一性抗体体一個個 B cell 只只产产生一生一种种抗抗体体 抗体X-a-b-c-d-a

25、 -b -c -d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和 脾脏产生各种 B 細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫 抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集 B 細胞免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次Ag X制备过程制备过程-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgXELISAHATPEG Cell fusion融合瘤细胞ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d新的抗原单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性 高度均一性：高度均一性：纯度很

26、高的均一性抗体纯度很高的均一性抗体 高度专一性：高度专一性：只对抗原分子上某一抗原决定只对抗原分子上某一抗原决定 簇起反应簇起反应 大量产生及稳定性：大量产生及稳定性：杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖 之传代之传代 McAb McAb 在治疗中存在的问题（障碍）在治疗中存在的问题（障碍）：1.McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应。2.完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体组织，达不到有效的治疗浓度。解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 三、基因工程抗体三、基因工程抗体(Genetic eng

27、ineering antibody)根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括 嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体等。(3)单域抗体抗体融合蛋白抗体融合蛋白 将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到具有多种生物学功能的融合蛋白，这些融合蛋白能利用抗体的特异性识别功能将某些生物活性导向特定部位。重点掌握1.抗体和免疫球蛋白的概念、2.免疫球蛋白的基本结构、功能区及其功能、3.抗体的生物学活性、了解：五类免疫球蛋白的特点与功能。4.ELISA法的主要类型及基本原理5.胶体金免疫快速检测法的主要类型

28、及基本原理6.多克隆抗体及单克隆抗体 5种免疫球蛋白的划分是根据：（）AH链和L链均不同 BV区不同 CL链不同 E连接H链的二硫键位置和数目不同 下列备选答案中，错误的是:A.抗体都是免疫球蛋白B.Ig单体分子一般是二价C.一种浆细胞产生的抗体分子与其表面抗原识别受体具有 相同的抗原结合特性D.铰链区连接免疫球蛋白的H链和L链E.超变区位于免疫球蛋白的可变区内DH链不同能与肥大细胞结合的Ig是：A.IgA B.IgD D.IgG E.IgMIgG分子中能与巨噬细胞上受体结合的功能区是：A.CL B.CH1区 C.CH2区与抗原结合后，激活补体能力最强的Ig是A.IgA B.IgG C.IgM D.IgDC.IgED.CH3区E.IgE 用ELISA双抗体夹心法检测血清中甲胎蛋白（AFP），应选择的固相包被物是:（）A.已知AFP B.酶标记AFP D.酶标记抗AFP抗体 E.待检血清酶联免疫吸附试验间接法所用的酶标记物是 A.酶标记抗体 B.酶标记抗补体C3b抗体C.酶标记抗原 C.抗AFP抗体D.酶标记抗抗体