实验四过碘酸雪夫反应课件.ppt

1、 细胞化学染色是细胞学和化学相结合的一门科学。它是以细胞形态学为基础，根据化学反应的原理、应用涂片染色的方法观察细胞的化学成分及其变化的重要方法。细胞化学染色研究的对象：细胞和组织中的化学物质细胞化学染色的要求：1.保持细胞的生前结构。2.保存细胞生前的化学成分和酶的活性。3.所用方法是已知的化学反应或物理变化。4.反应产物必须是一种有色物质，可以进行显微镜观察。5.反应产物不能移位，必须有一定的稳定性。细胞化学染色的步骤：1.固定：将细胞的生前结构和化学物质保存下来。2.显示：通过一系列化学反应形成稳定的有色沉淀。3.复染：使各种细胞都显示出来以便于观察。细胞化学染色的实用价值一、协助白血病

2、的诊断1.急性白血病细胞类型的鉴别。检查顺序：POX PAS NAE+NaF NCE2.协助慢性白血病的诊断。NAP PAS二、协助贫血的诊断1.缺铁性贫血：铁染色2.再障：NAP3.铁粒幼细胞性贫血：铁染色三、鉴别某些容易混淆的细胞以协助诊断四、协助鉴别良性与恶性的淋巴细胞疾病五、协助两种感染的鉴别实验四 过碘酸-雪夫反应(糖原染色)目的要求1掌握本实验的原理和临床意义。2熟悉本实验的操作方法及注意事项。实验原理 糖原中的1，2-乙二醇基经高碘酸氧化后产生醛基，此醛基进而与雪夫(Schiff)液作用，使无色品红变为红色的化合物，定位于胞浆中。实验器材和试剂 110gL高碘酸液 2雪夫(Sch

3、iff)染液 3亚硫酸液 420gL甲绿 5染色架、洗耳球、接水盘及吸水纸。6光学显微镜、香柏油、乙醚和擦镜纸。实验步骤1新鲜血片或骨髓片用95乙醇固定10min，蒸馏水冲洗，待干。210gL高碘酸氧化1520min，蒸馏水冲洗，待干。3置雪夫试液室温染色3060min。4用亚硫酸溶液冲洗3次后，以自来水冲洗23min，待干。520gL甲绿复染1020min。6水洗，待干，镜检。7结果 (1)阳性反应：在细胞浆内染红色，呈弥漫状、颗粒或块状。胞核染成绿色。阴性反应，胞浆无色。(2)反应强度判断标准：中性粒细胞的分级标准：()胞浆无红色颗粒。(+)胞浆内呈淡红色有极少颗粒。(+)胞浆呈红色，厚而

4、不透明，或有较少颗粒。(+)胞浆呈深红色，颗粒紧密，但尚有空隙。(+)胞浆呈深紫红色，颗粒紧密，无空隙。淋巴细胞分级标准：()胞浆内无颗粒。(+)胞浆内呈弥散淡红或有少数细颗粒(10个)。(+)胞浆内有较粗颗粒或少数小块状。(+)胞浆内呈多数粗颗粒并有大块红色物质。幼红细胞的分级标准：()胞浆内无颗粒。(+)胞浆内有少数分散细小颗粒或浅红色弥漫物质。(+)胞浆内有110个中等颗粒或弥漫的红色。(+)胞浆内有1120个较粗颗粒或呈深红色。(+)胞浆颗粒较多，20个以上，并且粗，致密且呈紫红色。巨核细胞的分级标准：()细胞内没有糖原，但细胞浆内有弥散性着色，此系其它多糖类物质。(+)含少量糖原，即

5、含数小块或一大块糖原，糖原常定位于近核膜处。(+)胞浆内含有中等糖原，即含许多小块或少数大块糖原，约占胞质的1/3。(+)胞浆内含有大量糖原，呈大块状，其总面积约占胞浆面积的1/2以上。（）胞浆内充满糖原。(3)阳性率和阳性积分：根据不同情况的需要，观察同一类细胞100个，求出阳性率的百分比，将百分率与分级数的积相加，其总和即为积分。实验五 过氧化物酶(POX)染色目的要求目的要求 1 掌握本实验的原理和临床意义。2 熟悉本实验的操作方法及注意事项。实验原理实验原理 细胞内的过氧化物酶能将底物的过氧化氢分解，产生新生态氧。后者将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝，它是一种不稳定的中间产物，再与亚硝基

6、铁氰化钠结合进而生成蓝黑色化合物沉淀于酶的所在部位。实验器材和试剂实验器材和试剂 1.0.3 联苯胺乙醇溶液 联苯胺 0.3 g 88 乙醇 加至100 ml 2.360gL亚硝基铁氰化钠饱和液 3.稀过氧化氢液（新鲜配制）3 过氧化氢 0.3 ml 蒸馏水 25 ml 4.瑞氏染液、PH 6.46.8磷酸盐缓冲液。5.光学显微镜、香柏油、乙醚和擦镜纸。6.染色架、洗耳球、接水盘及吸水纸。实验步骤实验步骤1.取0.3 联苯胺乙醇溶液 1ml，360gL亚硝基铁氰化钠饱和液10l，混匀。2.于新鲜干燥血涂片或骨髓片上滴加上述混合液0.5ml，使盖满整个血膜，作用12min。3.滴加等量的稀过氧化

7、氢液，混匀，染48min。4.勿倾去染液，直接用水冲洗。5.干燥后再用瑞氏染液复染。6.结果 在细胞的胞浆中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性反应。阳性反应强度的判断：阴性：无颗粒。弱阳性：颗粒小，分布稀疏。阳性：颗粒略粗，分布较密集。强阳性：颗粒粗大。实验六 碱性磷酸酶（NAP）染色目的要求1 掌握本实验的原理和临床意义。2 熟悉本实验的操作方法及注意事项。实验原理 中性粒细胞胞质内的碱性磷酸酶在PH 9.6的碱性条件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于胞浆中的酶活性处。实验步骤 1取新鲜血片自然干燥后放入95乙醇液固定10min，用流水冲洗，待干。2取基质液，预温

8、至37，将血片置入，继续温育46h。3滴加20gL硝酸钴，作用5 min，蒸馏水冲洗。4滴加20gL硫化铵，作用5 min，蒸馏水冲洗。5用20gL甲绿水溶液复染23 min或用10gL伊红复染35 min。6水洗，待干，镜检。7结果(1)正常人的血细胞碱性磷酸酶除中性成熟粒细胞(杆状核及分叶核)可见阳性外，其它细胞均呈阴性。(2)判断标准及分级：(-)0分：胞浆呈淡红色，无任何棕黑色颗粒。(+)1分：胞浆呈均匀浅色，无颗粒或有少量棕黑色颗粒，但不超过胞浆总面积的14。(+)2分：全部胞浆呈均匀棕黑色或出现较粗的黑色颗粒，不超过胞浆12。(+)3分：胞浆中已基本充满棕黑色颗粒，但密度较低。(+

9、)4分：全部胞浆充满粗大棕黑色颗粒而呈深黑色甚至掩盖其胞核。(3)计算积分值：油镜下计数100个中性杆状核、分叶核粒细胞，分别记录其分级情况，全部阳性反应细胞之和即阳性率。将得出各种积分的百分率乘以该积分数，然后相加即为总积分。实验七 铁染色目的要求1掌握本实验的原理和临床意义。2熟悉本实验的操作方法及注意事项。实验原理 骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后而游离，并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内铁也可用此法显示。根据反应的强弱了解骨髓中铁的含量。实验器材和试剂1.甲醇2200g/L亚铁氰化钾溶液3浓盐酸4.2g/L核固红-硫

10、酸铝溶液 实验步骤1选髓粒丰富的骨髓片，用甲醇固定10min。2.配制酸性亚铁氰化钾溶液：200g/L亚铁氰化钾溶液 5份 浓盐酸 1份3玻片上滴满酸性亚铁氰化钾溶液，染色30min。4用蒸馏水冲洗后用2g/L核固红-硫酸铝溶液复染1015min。5流水冲洗、待干、镜检。6结果 (1)在红色背景下铁粒呈蓝绿色。(2)细胞外铁：用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。(-)：无颗粒所见。(+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠。(+)：有较多的铁颗粒和小珠。(+)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。(+)：有极多铁颗粒、小珠，有很多的小块，密集成堆。(3)细胞内铁：用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞浆中含有蓝色铁粒的细胞(铁粒幼红细胞)的百分率。并根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为四型：I型：幼红细胞内含铁粒12粒；型：幼红细胞内含铁粒35粒；型：幼红细胞内含铁粒610粒；型：幼红细胞内含铁粒10粒。(4)环形铁粒幼红细胞的标准为含铁粒在6粒以上，其中23以上的铁粒围核成完全或不完全性环形(围核12以上的区域有铁粒环绕)。