复旦大学酶学课件.ppt

1、1生命有机体必须能够生命有机体必须能够复复制自身制自身；有机体必须能够有效和有机体必须能够有效和选择性地选择性地催化化学反应催化化学反应。2生物无论多少复杂、多样，都需生物无论多少复杂、多样，都需要要酶酶（enzyme)。酶和生命活动密切相。酶和生命活动密切相关，关，几乎参加了所有的几乎参加了所有的生命活动生命活动和和生生命过程命过程。催化剂是一类能催化剂是一类能改变化学反应速改变化学反应速度度但但不改变反应性质、方向、平衡点不改变反应性质、方向、平衡点的物质，在反应前后的物质，在反应前后自身不发生化学自身不发生化学变化变化。3 u新陈代谢新陈代谢糖、脂、蛋白质、核酸等糖、脂、蛋白质、核酸等生

2、物合成生物合成和和降解降解代谢及其代谢及其代谢调节代谢调节。u分子生物学的分子生物学的 “钥匙钥匙”（工具酶工具酶）限制性内切酶、连接酶、聚合酶、反转录限制性内切酶、连接酶、聚合酶、反转录酶、酶、核酸酶、磷酸酯酶等。核酸酶、磷酸酯酶等。u广泛的生物学意义广泛的生物学意义 细胞生长、分化及凋亡、信号转导、神经细胞生长、分化及凋亡、信号转导、神经活动、肌肉收缩、肿瘤发生等。活动、肌肉收缩、肿瘤发生等。4酶酶 希腊语原意希腊语原意:酶是由生物酶是由生物活细胞产生活细胞产生的，能在的，能在体内体外起同样催化作用体内体外起同样催化作用的一类具有的一类具有活性中心和特殊构象活性中心和特殊构象的生物大分子，

3、的生物大分子，酶是酶是生物催化剂生物催化剂。5 一个化学反应中，开始时，反应物（一个化学反应中，开始时，反应物（S）的平）的平均能量水平较低（均能量水平较低（初态初态，initial state)（A），在），在反应的任何一刻，反应物中都有一部分分子具反应的任何一刻，反应物中都有一部分分子具有比初态更高一些的能量，高出的这部分能量有比初态更高一些的能量，高出的这部分能量为为活化能活化能（activation energy)，使这些分子进入，使这些分子进入过渡态过渡态（transition state)，即，即活化态活化态（A*)，这时，这时就能形成或打破一些化学键，形成新的物质就能形成或打破一

4、些化学键，形成新的物质-产产物物(P）。这些具有较高能量、处于活化态的分）。这些具有较高能量、处于活化态的分子为子为活化分子活化分子，反应物中这种分子愈多，反应反应物中这种分子愈多，反应速度就愈快速度就愈快。活化能就是在一定温度下。活化能就是在一定温度下1 mol底底物全部进入活化态所需要的自由能（物全部进入活化态所需要的自由能（J/mol）。）。67酶及其他催化剂一样，能降低化学反应的酶及其他催化剂一样，能降低化学反应的活化能。活化能。催化反应中只需较少的能量就可使反催化反应中只需较少的能量就可使反应物进入应物进入“活化态活化态”，及非催化反应比，及非催化反应比，活化活化分子的数量大大增加，

5、加快了反应速度分子的数量大大增加，加快了反应速度。如。如H2O2的分解，的分解，没有催化剂没有催化剂时的活化能为时的活化能为75.24 kJ/mol，用，用胶态钯作催化剂胶态钯作催化剂，活化能只需，活化能只需48.9 kJ/mol；而；而过氧化氢酶催化过氧化氢酶催化时，活化能下降到时，活化能下降到8.36 kJ/mol以下。以下。酶作为催化剂参加一次化学反应后立即恢酶作为催化剂参加一次化学反应后立即恢复到原来状态，继续催化反应。复到原来状态，继续催化反应。891、酶溶液是、酶溶液是高分子胶体高分子胶体，而且是，而且是两性电解质两性电解质，在电场中可发生泳动，活性在电场中可发生泳动，活性-pH曲

6、线及两性离曲线及两性离子的解离曲线相似。子的解离曲线相似。2、导致蛋白质变性的因素往往也能使酶、导致蛋白质变性的因素往往也能使酶变性变性。3、通常能被、通常能被蛋白水解酶水解蛋白水解酶水解丧失活性。丧失活性。4、高度纯化的酶的、高度纯化的酶的化学组成化学组成表现为蛋白质。表现为蛋白质。5、根据、根据RNase的一级结构，从的一级结构，从氨基酸合成了有氨基酸合成了有相同催化活性的蛋白质产物相同催化活性的蛋白质产物。10 上世纪上世纪70-80年代，发现年代，发现核糖核酸酶核糖核酸酶P等酶，除蛋白质等酶，除蛋白质外还包含外还包含RNA（对（对RNase P，RNA占占77%），且后者在），且后者在

7、催化过程起着催化过程起着不可或缺不可或缺的作用。的作用。Altman发现该酶可发现该酶可耐耐受胰蛋白酶受胰蛋白酶的作用，但的作用，但 RNase A处理失去活性处理失去活性；将蛋白；将蛋白质及质及RNA分开后，单独都不表现分开后，单独都不表现RNase P活性；活性；重组后重组后恢复活性恢复活性。Cech在研究在研究rRNA加工中发现加工中发现rRNA前体本身就具有前体本身就具有催化能力催化能力。之后，。之后，Altman和和Pace两家实验室同时证明两家实验室同时证明RNA的催化能力的催化能力-核酶核酶（Ribozyme）。）。Cech和和Altman因此获因此获1989诺贝尔奖诺贝尔奖。其

8、后，还有大量。其后，还有大量RNA催化剂的催化剂的报道，甚至还有报道，甚至还有DNA催化剂及糖催化剂催化剂及糖催化剂的报道。但这的报道。但这些并不否定些并不否定“酶的化学本质是蛋白质酶的化学本质是蛋白质”的结论。的结论。111、所有的、所有的酶都是由生物体产生酶都是由生物体产生的，几乎所有的生物包的，几乎所有的生物包括病毒都能编码和合成酶。括病毒都能编码和合成酶。2、酶、酶及生命活动密切相关及生命活动密切相关（1）酶参及了生物体内所有的）酶参及了生物体内所有的生命活动和生命过程。生命活动和生命过程。（执行具体（执行具体生理机能生理机能；清除有害物质清除有害物质；协同激素协同激素等生理等生理活性

9、物质在体内发挥活性物质在体内发挥信号转换信号转换、传递和放大作用传递和放大作用，调节，调节生理过程和生命活动；生理过程和生命活动；催化代谢反应催化代谢反应）。）。（2）酶的组成和分布是）酶的组成和分布是生物进化及组织功能分化的基生物进化及组织功能分化的基础础。（3）酶能在）酶能在多种水平上进行调节多种水平上进行调节以适应各种生命活动以适应各种生命活动的需要。的需要。12酶具有一般催化剂的特点，如酶具有一般催化剂的特点，如加快反应速度加快反应速度、反应前后无变化反应前后无变化、不改变反应的平衡点不改变反应的平衡点。酶还具有自身的特点：酶还具有自身的特点：1、催化、催化效率高效率高：比非催化反应高

10、：比非催化反应高108-1020，比其他催化比其他催化反应高反应高107-1013。2、酶活性、酶活性受环境变化的影响，易失活受环境变化的影响，易失活。3、生物体内，酶活性、生物体内，酶活性受到其他因素的调节和控制受到其他因素的调节和控制。4、酶的催化作用具有、酶的催化作用具有高度专一性高度专一性：结构专一性（绝对：结构专一性（绝对专一性和相对专一性）和立体异构专一性。专一性和相对专一性）和立体异构专一性。1314 生物化学的研究史多数是酶研究的历史。对生生物化学的研究史多数是酶研究的历史。对生化催化剂的认识始于化催化剂的认识始于1700s的后期对于的后期对于胃分泌物胃分泌物对肉的消化对肉的消

11、化；1800s继续于继续于唾液对淀粉转化为糖唾液对淀粉转化为糖的研究；的研究；1857，Louis Pasteur总结总结酵母发酵糖为酵母发酵糖为酒精酒精由由“酵素酵素”催化（但不能从活的机体分离催化（但不能从活的机体分离）；）；1897，Eduard Buchner发现发现酵母抽提物可以发酵糖为乙醇酵母抽提物可以发酵糖为乙醇，确定催化由分子，确定催化由分子执行，并能由细胞分离。执行，并能由细胞分离。Frederick W.Khne称称这些分子为这些分子为酶酶，；1913，米氏方米氏方程建立程建立。1926，James Sumner分离和结晶了脲酶，分离和结晶了脲酶，成成为早期酶研究的重大突破

12、为早期酶研究的重大突破酶分子是蛋白质酶分子是蛋白质（所（所有酶都是蛋白质）；有酶都是蛋白质）；1930s，很多蛋白酶被结晶，很多蛋白酶被结晶，Sumner的结论被广泛接受。至今已鉴定的酶超的结论被广泛接受。至今已鉴定的酶超过三千种以上。过三千种以上。15 一般认为，酶学研究一般认为，酶学研究开始于开始于1897年年 Buchner兄弟的发现兄弟的发现，表明，表明酶能以酶能以溶解溶解的和的和活性活性的状态的状态从细胞中分离从细胞中分离，推动，推动了酶分离、酶理化性质、生命过程及了酶分离、酶理化性质、生命过程及酶关系的研究。酶关系的研究。其后沿着两个方向发展，其后沿着两个方向发展，一一是以是以Ta

13、kamine等开始的酶的等开始的酶的应用研究应用研究，采，采用各种分离纯化技术制备了不同的用各种分离纯化技术制备了不同的酶酶制剂制剂，发展了，发展了固定化酶技术固定化酶技术，建立了，建立了多种类型的多种类型的酶反应器酶反应器。16二二是从事酶的是从事酶的理论研究理论研究，侧重于酶的，侧重于酶的理化理化性质性质及及催化性质催化性质的研究。的研究。Summer和和Northrop开开辟了酶的辟了酶的分离纯化分离纯化道路；道路；Sanger、Moore和和Stein等建立了酶等建立了酶一级结构测定一级结构测定方法；方法；Kendrew等发展了等发展了X-衍射衍射晶体分析晶体分析方法，用于结构及功方法

14、，用于结构及功能的研究；能的研究；Michaelis和和Menten等为等为酶反应的动酶反应的动力学力学打下坚实基础；打下坚实基础；Fischer和和Koshland提出了提出了酶作用的酶作用的锁及钥匙学说锁及钥匙学说及及诱导契合学说诱导契合学说。还有。还有许多则侧重于酶的生物学研究，如许多则侧重于酶的生物学研究，如Hill和和Meyerhof等确立了等确立了糖酵解系统糖酵解系统；Krebs等建立等建立了了三羧酸循环三羧酸循环；Jacob等提出了等提出了酶合成的操纵调酶合成的操纵调节机制节机制；Temin和和Baltimore发现了发现了反转录酶反转录酶；Arber等的等的限制性内切核酸酶限制

15、性内切核酸酶等等。等等。17现代酶学现代酶学沿着两个方向发展：沿着两个方向发展：酶的分子生酶的分子生物学物学和和酶工程（学）酶工程（学）。酶分子生物学酶分子生物学的任务是的任务是深入揭示酶的深入揭示酶的结构及功能的关系结构及功能的关系、酶的、酶的催化机催化机制及调节机制制及调节机制、酶、酶与生命活动的关系与生命活动的关系、进一步、进一步设计和改造酶设计和改造酶、在、在基因水平进行酶的调节和控基因水平进行酶的调节和控制制。酶工程（学）酶工程（学）的任务是要解决如何的任务是要解决如何更经济更经济有效地进行酶的生产、制备和应用有效地进行酶的生产、制备和应用。将基因工。将基因工程、分子生物学成果用于酶

16、的生产。进一步开程、分子生物学成果用于酶的生产。进一步开发固定化酶技术和酶反应器。发固定化酶技术和酶反应器。18年年 Reaumur（法）胃液消化作用研究（法）胃液消化作用研究 年年 Spallamzan 发现鸟的胃液能消化肉发现鸟的胃液能消化肉年年 Kirchhoff发现稀酸对淀粉的分解作用发现稀酸对淀粉的分解作用【麦芽抽麦芽抽提液加入淀粉后能生成麦芽糖提液加入淀粉后能生成麦芽糖,即麦芽抽提液中必定即麦芽抽提液中必定有能水解淀粉的水溶性物质有能水解淀粉的水溶性物质ferment(酵素酵素)】年年 Mitscherlich提倡水溶性酵素为提倡水溶性酵素为 unorganized ferment

17、 年年 Kuhlne，首次使用，首次使用Enzyme这一术语这一术语年年 Payen&Persoz 从麦芽抽提液得到了从麦芽抽提液得到了 ferment,称称diastase【溶于水、稀酸溶于水、稀酸,但不溶于高浓度但不溶于高浓度酒精酒精,即现在的即现在的amylase】年年 Berzelius提出提出ferment起的是催化作用起的是催化作用19年年 Pasteur认为发酵分几个阶段进行认为发酵分几个阶段进行,每一步都有每一步都有特定的酶参及特定的酶参及,但酶只在活体细胞中才能起作用。但酶只在活体细胞中才能起作用。年年 Bertrand发现了水解酶以外的酶。发现了水解酶以外的酶。年年 Buc

18、hner兄弟以兄弟以“没有酵母的酒精发酵没有酵母的酒精发酵”证明证明了酶可以离开细胞起作用。了酶可以离开细胞起作用。年年 Halden&Young 发现酶是蛋白质及耐热性低发现酶是蛋白质及耐热性低分子量化合物分子量化合物(cofactor)的复合物的复合物,提出蛋白质只是担提出蛋白质只是担体。体。年年 米氏方程建立。米氏方程建立。年年 Sumner得到了得到了Urease的结晶的结晶【1 2年后年后,Northrop结晶化了结晶化了Pepsin,Trypsin等蛋白酶等蛋白酶】结晶中结晶中测定不到测定不到cofactor。20年年 Warburg发现呼吸链诸酶中的血红素发现呼吸链诸酶中的血红素

19、 【1935-1936年维生素及辅酶的关系的解明年维生素及辅酶的关系的解明】年年 Sabbarow发现发现ATP【1939-1940年，年，F.Lipmann解明高能磷酸化合物的生理意义解明高能磷酸化合物的生理意义】年年 Sutherland cAMP的发现的发现-酶及激素的关酶及激素的关系系年年 Restriction enzyme的发现的发现-基因工程基因工程年年 Thomas R.Cech和和Sidney Altman 在研在研究究RNA分子剪切机理时发现分子剪切机理时发现RNA分子也有催化分子也有催化能力。能力。21 1907 Buchner,E.酵母无细胞提取液的酵母无细胞提取液的酒

20、精发酵酒精发酵作用作用 1929 Euler-Chelpin,H.&Harden,A.糖发酵糖发酵及其有关酶及其有关酶 1931 Warburg,O.呼吸酶呼吸酶及其作用机制及其作用机制 1946 Northrop,J.,Stanley,W.,&Sumner,J.（脲）酶结晶（脲）酶结晶 1947 Cori,C.,&Cori,G.糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶 1955 Theorell,A.氧化酶氧化酶 1959 Kornberg,A.DNA聚合酶聚合酶 1971 Sutherland cAMP（腺苷酸环化酶，第二信使）（腺苷酸环化酶，第二信使）1975 Baltimore,D.,Dulbecco

21、,R.,&Temin,H.逆转录酶逆转录酶 1978 Arber,W.,Nathans,D.&Smith,H.DNA限制性内切酶限制性内切酶 1982(9)Thomas R Cech&S.Altman 核酶核酶的发现的发现 1992 Fischer,E.,&Krebs,E 糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶可逆磷酸化可逆磷酸化 1994 Rodbell,M.,&Gilman,A.G蛋白蛋白2223 全酶全酶(holoenzyme)|酶蛋白（酶蛋白（apoenzyme)+辅助因子辅助因子（cofactor)辅基辅基 prosthetic group辅酶辅酶 co-enzyme金属离子金属离子 (也可归入辅

22、基也可归入辅基)结合力强结合力强2425包括包括金属离子和有机化合物金属离子和有机化合物，本身无催化，本身无催化作用，除作用，除稳定酶的构象稳定酶的构象外，一般在酶促反应中外，一般在酶促反应中运运输转移电子、原子或某些功能基团输转移电子、原子或某些功能基团。有些蛋白质。有些蛋白质也具有这种作用，被称为也具有这种作用，被称为蛋白辅酶蛋白辅酶。及酶蛋白结合松驰的辅助因子，可以通过及酶蛋白结合松驰的辅助因子，可以通过透析或超滤等除去，被称为透析或超滤等除去，被称为辅酶辅酶(cofactor或或coenzyme)。有一些辅助因子以共价的形式及酶蛋白牢有一些辅助因子以共价的形式及酶蛋白牢固地结合在一起，

23、不能通过透析或超滤除去，被固地结合在一起，不能通过透析或超滤除去，被称为称为辅基辅基(prosthetic group)。26根据酶蛋白分子的特点将酶分为三类：根据酶蛋白分子的特点将酶分为三类：单体酶单体酶(monomeric enzyme)，只有一条多肽链，很少，一般是，只有一条多肽链，很少，一般是催化水解反应的酶，如胰蛋白酶等。催化水解反应的酶，如胰蛋白酶等。寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzyme)，分子量，分子量35000-几百万，由几个甚至几百万，由几个甚至几十个亚基组成，亚基一般无活性，可以相同也可以，亚基间非几十个亚基组成，亚基一般无活性，可以相同也可以，亚基间非共价结合

24、，容易分开，如共价结合，容易分开，如3-磷酸甘油醛脱氢酶。磷酸甘油醛脱氢酶。多酶体系多酶体系(multienzyme system)，由几种酶彼此嵌合形成的复合，由几种酶彼此嵌合形成的复合体，有利于一系列反应的连续进行，分子量一般在几百万。体，有利于一系列反应的连续进行，分子量一般在几百万。还有人将多种不同催化功能存在于一条多肽链中的酶称为还有人将多种不同催化功能存在于一条多肽链中的酶称为多多功能酶功能酶(multifunctional enzyme)或或串联酶串联酶(tandem enzyme)，由于，由于多酶体系在进化过程中基因的融合造成的多酶体系在进化过程中基因的融合造成的。27习惯命名

25、法习惯命名法（1961年前）年前）：根据根据底物的名称底物的名称：淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶：淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶根据根据反应的性质反应的性质：转氨酶、脱氢酶、脱羧酶：转氨酶、脱氢酶、脱羧酶以催化的以催化的性质和底物名称性质和底物名称：乳酸脱氢酶：乳酸脱氢酶以酶的以酶的来源或其他性质来源或其他性质：牛小肠碱性磷酸酯酶：牛小肠碱性磷酸酯酶国际系统命名法国际系统命名法：谷丙转氨酶：谷丙转氨酶：L-Ala：-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶 草酸氧化酶：草酸：氧氧化酶草酸氧化酶：草酸：氧氧化酶 乙酰辅酶乙酰辅酶A水解酶：乙酰辅酶水解酶：乙酰辅酶A：水解酶：水解酶28EC(Enzyme Commis

26、ion)号的第一个数字号的第一个数字1.Oxido-reductases 氧化还原酶类氧化还原酶类2.Transferases 转移酶类转移酶类3.Hydrolases 水解酶类水解酶类4.Lyases/synthases （裂）合酶类（裂）合酶类5.Isomerases 异构酶类异构酶类6.Ligase/synthetases 连接连接(合成）酶类合成）酶类1961年，国际生物化学学会年，国际生物化学学会酶学委员会酶学委员会对自然界存在的酶进行对自然界存在的酶进行了广泛的研究，对每一个酶给出了一个习惯名称和系统名称。了广泛的研究，对每一个酶给出了一个习惯名称和系统名称。2930EC1.1.1

27、.27酶学委员会酶学委员会Enzyme Commision六大类酶的六大类酶的1-61-6类类作用的基团或键的特作用的基团或键的特点分成的点分成的亚类亚类亚类按顺序再编成亚类按顺序再编成亚亚类亚亚类该酶在亚亚类该酶在亚亚类中的次序中的次序31研究酶研究酶反应速度规律反应速度规律以及以及各种因素对各种因素对酶反应速度影响酶反应速度影响的科学的科学Kinetics of Enzyme-catalyzed Reactions32前提：前提：I.单底物、单产物反应单底物、单产物反应II.反应速度取其反应速度取其初速度初速度，即反应刚刚开始，产，即反应刚刚开始，产物的生成量极少，逆反应可不予考虑物的生成

28、量极少，逆反应可不予考虑III.底物浓度远远大于酶浓度底物浓度远远大于酶浓度在其他因素不变的情况下，底物浓度在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈对反应速度的影响呈矩形双曲线关系矩形双曲线关系（rectangular hyperbola)33SVVmax当当底物浓度较低底物浓度较低时：底物被酶时：底物被酶饱和，反应速度及底物浓度成正比，饱和，反应速度及底物浓度成正比，反应相对于底物为反应相对于底物为一级反应一级反应。first order reaction34随着随着底物浓度的增高底物浓度的增高：反应速度：反应速度不再成正比例加速，相对于底物反应不再成正比例加速，相对于底物反应表现

29、为表现为混合级反应混合级反应。SVVmaxmixed order reaction35SVVmax当当底物浓度高达一定程度底物浓度高达一定程度：酶为：酶为底物所饱和，反应速度不再随底物浓底物所饱和，反应速度不再随底物浓度增加，达最大反应速度，相对于底度增加，达最大反应速度，相对于底物反应为物反应为零级反应零级反应。zero order reaction36051015050100150200250300水解时间(m i n)DH(%)537酸性蛋白酶，5 0，p H 3,E/S=4%（酶 与 底 物 的 浓 度 之比）AS1398中性蛋白酶5 0，p H7,E/S=2%胰蛋白酶3 7，pH8,

30、E/S=4%胰酶3 7 ，p H 8,E/S=4%Alcalase60,pH8,E/S=12AU(安 森单位)/K g木瓜蛋白酶，6 0,p H 5,E/S=10%Protamex50,pH6.5,E/S=24AU/Kg酶催化反应进程曲线酶催化反应进程曲线碱性内切蛋白酶碱性内切蛋白酶37first order reactionmixed order reactionzero order reaction酶催化应速度及底物浓度的关系酶催化应速度及底物浓度的关系38S+E ES E+PS:substanceP:productE:enzymepre-steady stateES formingste

31、ady state-ES almost constant39)底物减少量底物减少量40实验测定中，只有测定反应实验测定中，只有测定反应初速度才有意义，且是不同初速度才有意义，且是不同底物浓度下的反应初速度。底物浓度下的反应初速度。41酶反应的基本动力学关系是指酶反应的基本动力学关系是指酶酶反应速度反应速度及及酶酶和和底物底物间的动力学关系间的动力学关系。酶和底物是构成酶反应系统最基本的酶和底物是构成酶反应系统最基本的因素，决定着酶反应的基本性质、酶因素，决定着酶反应的基本性质、酶反应的速度规律。反应的速度规律。描写这种基本动力学关系的是描写这种基本动力学关系的是米米氏方程氏方程（Michael

32、is-Menten equation）。）。4243 首先要确定反应的机制，即首先要确定反应的机制，即反应方式反应方式和和反应历反应历程程。酶反应有多种描述作用机制的学说，得到较。酶反应有多种描述作用机制的学说，得到较多实验支持的是多实验支持的是“活性中间络合物学说活性中间络合物学说”（intermediate complex hypothesis)（1903年年Wurtz和和Victor Henri提出），认为酶反应都要提出），认为酶反应都要通过通过酶及底物结合形成酶及底物结合形成酶酶-底物络合物底物络合物（中间（中间物），再由酶催化转化为物），再由酶催化转化为产物产物，同时释放出酶来，同时

33、释放出酶来参加下一轮酶反应。参加下一轮酶反应。1913年年，Leonor Michaelis和和Maud Menten扩展并提出：扩展并提出：E+S ES E+Pk1k2k344假设假设 E+S ES 的平衡迅速建立的平衡迅速建立 反应初速度由最高速度及底物浓度决定反应初速度由最高速度及底物浓度决定 v =Vmax f(S)v =Vmax/(1+C/S)或或 v =Vmax SC+S根据实验数据推导根据实验数据推导45k1k2k3k4=46 根据根据稳态假设稳态假设，反应早期的，反应早期的P可以忽略，并假设可以忽略，并假设k4也可略。也可略。则则V0=k3ES，即，即ES分解为产物的速度决定着

34、分解为产物的速度决定着V0，但，但ES无法实无法实验测定，验测定，必须找到必须找到ES其他的数量表达方式其他的数量表达方式。首先引入首先引入E0表示总的酶浓度，游离或非结合的酶表示总的酶浓度，游离或非结合的酶=E0-ES。由于由于SE0，因此，因此被酶结合掉的底物浓度可永远忽略被酶结合掉的底物浓度可永远忽略。第一步第一步，ES的形成和分解速度的形成和分解速度决定于决定于k1、k2及及k3 ES的形成速度的形成速度=k1(E0-ES)S ES的分解速度的分解速度=k2ES+k3ES 第二步第二步，重要假设，重要假设，V0反映了一种稳定态反映了一种稳定态，ES是常数，即是常数，即ES的的形成速度及

35、分解速度相等形成速度及分解速度相等稳态假说稳态假说。则则 k1(E0-ES)S=k2ES+k3ES47推导过程推导过程【续续】第三步第三步，对以上，对以上方程求方程求ES k1E0S=(k1S+k2+k3)ES ES=k1E0S/(k1S+k2+k3)令：令：(k2+k3)/k1=Km，即，即Michaelis constant（米氏常数）（米氏常数）ES=E0S/(Km+S)第四步第四步，V0可以用可以用ES表示，同时表示，同时Vmax=k3E0：V0=k3ES=k3E0S/(Km+S)=VmaxS/(Km+S)即为单底物即为单底物-酶反应的酶反应的米氏方程或速度方程米氏方程或速度方程，是通

36、过，是通过米氏常数米氏常数Km定量描述定量描述V0、Vmax和和S之间关系的方程之间关系的方程。48当当V0=1/2 Vmax，则，则Km=S，表明当反应初速度为最大反表明当反应初速度为最大反应速度一半时，应速度一半时，Km代表了代表了底物浓度。底物浓度。在低在低S时，时，KmSV0=VmaxS/Km,V0S在高在高S，当，当SKm,V0=Vmax。反应初速度及底物浓反应初速度及底物浓度的依赖关系度的依赖关系49米氏方程描述的是米氏方程描述的是大多数酶的动力学行为大多数酶的动力学行为，表现，表现为为。所。所有表现为有表现为（例（例外的主要是外的主要是变构酶变构酶）。）。米氏方程并不决定于他们提

37、出的米氏方程并不决定于他们提出的相对简单的两步反应机制相对简单的两步反应机制。多数遵循米氏动力学的酶都。多数遵循米氏动力学的酶都有十分复杂的反应机制，可以确定有有十分复杂的反应机制，可以确定有6步或步或8步催化反应步催化反应的酶通常表现出同样的稳定态的动力学行为。对于的酶通常表现出同样的稳定态的动力学行为。对于，。Vmax和和Km是可以通过实是可以通过实验测定的任何酶的参数，但对于反应的数目、速度或过验测定的任何酶的参数，但对于反应的数目、速度或过程不连续步骤的化学本质，则提供不了什么信息。程不连续步骤的化学本质，则提供不了什么信息。50（1）Km=（k2+k3)/k1，速度常数由酶反应性质及

38、反应速度常数由酶反应性质及反应条件决定条件决定，对特定的酶反应、反应条件来说，对特定的酶反应、反应条件来说，Km是一是一个个特征常数特征常数。（2）当）当v=Vmax/2，Km=S，Km是反应速度达到最大反是反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度应速度一半时的底物浓度，Km的单位是的单位是浓度单位浓度单位。（3）不同酶的不同酶的Km不同不同，同一种酶对于不同底物的同一种酶对于不同底物的Km值有可能不同值有可能不同，有时用于表示，有时用于表示酶对底物的亲和力酶对底物的亲和力。（4）当）当k3为限速时，若为限速时，若k3k2，Km=k2/k1，被称为，被称为ES复合物的复合物的解离常数解离常数K

39、d，这时的，这时的Km代表了酶及底物的亲代表了酶及底物的亲和力。但这一假定对多数酶不适用，有时和力。但这一假定对多数酶不适用，有时k3k2，这时，这时Km=k3/k1，Km不能简单地被用作亲和力不能简单地被用作亲和力。515253 鉴定酶鉴定酶 判断酶的最适底物判断酶的最适底物 计算一定反应速度下的底物浓度计算一定反应速度下的底物浓度 了解酶的底物在体内具有的浓度水平了解酶的底物在体内具有的浓度水平 判断反应方向或趋势判断反应方向或趋势 判断抑制类型判断抑制类型54（5）不同酶的）不同酶的Vmax也不同，如果一个酶是两步米氏反也不同，如果一个酶是两步米氏反应机制，应机制，Vmax=k3E0，k

40、3为限速。但反应步骤及反应的为限速。但反应步骤及反应的限速过程不同，情况则更为复杂。这时使用另一个有用限速过程不同，情况则更为复杂。这时使用另一个有用的更常见的速度常数的更常见的速度常数kcat来来描述任何一个饱和状态酶催描述任何一个饱和状态酶催化反应的限制速度化反应的限制速度。如果反应中有几步反应，其中的一。如果反应中有几步反应，其中的一步是限速的，步是限速的，kcat就是这步限速反应的速度常数，通常就是这步限速反应的速度常数，通常是是形成产物的那步反应的常数形成产物的那步反应的常数。如果几步反应都是部分。如果几步反应都是部分限速，限速，kcat则非常复杂，这时称为则非常复杂，这时称为转换数

41、转换数（turenover number)，即当酶被底物饱和时，在，即当酶被底物饱和时，在一定时间内一定时间内1个酶个酶分子转化底物分子为产物的数量分子转化底物分子为产物的数量。kcat是一级速度常数，是一级速度常数，单位是时间的倒数单位是时间的倒数。5556 动力学参数动力学参数kcat和和Km对于研究和比较不同的酶是有用对于研究和比较不同的酶是有用的，无论它们的作用机制是简单还是复杂，的，无论它们的作用机制是简单还是复杂，每个酶都有每个酶都有反映细胞环境、通常的体内底物浓度、催化反应最合适反映细胞环境、通常的体内底物浓度、催化反应最合适的的kcat和和Km。kcat和和Km参数还可用于参数

42、还可用于评价酶的动力学效率评价酶的动力学效率，但两者，但两者单独表示都不够，不同酶催化不同反应的单独表示都不够，不同酶催化不同反应的kcat可能一样，可能一样，Km对于细胞内环境的底物浓度可能也相近。比较不同酶对于细胞内环境的底物浓度可能也相近。比较不同酶的催化效率或同一种酶不同底物的转换数最好的方法是的催化效率或同一种酶不同底物的转换数最好的方法是比较它们的比较它们的kcat/Km，这一参数被称为，这一参数被称为特异性常数特异性常数（specificity constant)，是，是E+S转变为转变为E+P的速度常数的速度常数。当当SKm，V0=(kcat/Km)E0S。常数的。常数的单位是

43、二级单位是二级速度常数：速度常数：M-1s-1。E和和S在溶液中扩散到一起的速率决在溶液中扩散到一起的速率决定了定了 kcat/Km存在一个上限，这种存在一个上限，这种扩散控制极限为扩散控制极限为108到到109 M-1s-1。许多酶都在这个范围附近，不同的。许多酶都在这个范围附近，不同的kcat和和Km值可以产生最大的比值。值可以产生最大的比值。5758 米氏方程可以转变为更为有用的作图实验数米氏方程可以转变为更为有用的作图实验数据，两边都采用倒数表示：据，两边都采用倒数表示：这样的米氏方程被称为这样的米氏方程被称为Lineweaver-Burk方程方程，以以1/V0对对1/S（双倒数）作图

44、，产生一条直线。（双倒数）作图，产生一条直线。直线的直线的斜率为斜率为Km/Vmax，纵坐标上的截距为纵坐标上的截距为1/Vmax，横坐标上的截距为横坐标上的截距为-1/Km。59实验测定酶动力学时，只要测实验测定酶动力学时，只要测定不同底物浓度下的反应初速定不同底物浓度下的反应初速度，通过作图法就可以求得特度，通过作图法就可以求得特定酶的酶反应的动力学数据。定酶的酶反应的动力学数据。横坐标上截距的负倒数就横坐标上截距的负倒数就是酶反应的是酶反应的Km，纵坐标上，纵坐标上截距的倒数是酶反应的最截距的倒数是酶反应的最大反应速度。大反应速度。60S0/vS0作图作图vv/S0作图作图v=-Km(v

45、/S)+VmaxVmaxVmax/KmS0/v=Km/Vm+S0/Vm6162 当当S E 时，反应速度及时，反应速度及E变化变化成正比，即成正比，即V=K3 EVE063 有时候酶催化两个或更多个不同底物反应，如有时候酶催化两个或更多个不同底物反应，如己糖激酶催化：己糖激酶催化：ATP+Glc ADP+G-6-P，有，有两个底物和两个产物，可以用米氏方程分析，脑两个底物和两个产物，可以用米氏方程分析，脑中己糖激酶对中己糖激酶对ATP、葡萄糖及果糖的、葡萄糖及果糖的Km分别为分别为0.4、0.05和和1.5 mM。双底物反应往往涉及一个原子或功能基团从一双底物反应往往涉及一个原子或功能基团从一

46、个底物转移到另一个底物，这些反应可以有几种个底物转移到另一个底物，这些反应可以有几种不同的方式进行，但有时两个底物可同时及酶结不同的方式进行，但有时两个底物可同时及酶结合，合，形成非共价的三重复合物形成非共价的三重复合物。或第一个底物结。或第一个底物结合就形成产物或在第二个底物结合前就解离，合就形成产物或在第二个底物结合前就解离，没没有三重复合物形成有三重复合物形成乒乓机制乒乓机制或或双取代反应机制双取代反应机制。64有序机制有序机制随机机制随机机制乒乓反应机理乒乓反应机理(ping pong mechanism)65稳态动力学提供的两个最重要的实验稳态动力学提供的两个最重要的实验参数是参数是

47、kcat和和kcat/Km。pH或温度改变导致的或温度改变导致的这些参数的变化能提供有关反应过程的另这些参数的变化能提供有关反应过程的另外信息。在双底物反应中，外信息。在双底物反应中，稳态动力学能稳态动力学能帮助决定反应中是否形成了三复合物帮助决定反应中是否形成了三复合物。66S2一定时，一定时，S1 及及v的动力的动力学关系。不同学关系。不同S2产生几条独产生几条独立曲线，交叉线表示反应中有立曲线，交叉线表示反应中有三合物形成。三合物形成。平行线表示为乒乓反应机制或平行线表示为乒乓反应机制或双取代反应机制。双取代反应机制。6768 酶抑制剂是酶抑制剂是干扰干扰酶催化反应、酶催化反应、减缓或中

48、断减缓或中断酶反酶反应的物质。酶实际上催化所有的细胞过程，因此应的物质。酶实际上催化所有的细胞过程，因此酶的抑制剂是已知的许多重要的酶的抑制剂是已知的许多重要的药物药物，如阿司匹，如阿司匹林（乙酰水杨酸）抑制前列腺素合成第一步催化林（乙酰水杨酸）抑制前列腺素合成第一步催化反应的酶（反应的酶（Cox）。酶抑制剂的研究）。酶抑制剂的研究能为酶反应能为酶反应机制提供有用信息机制提供有用信息，能，能帮助研究一些代谢途径帮助研究一些代谢途径。有两大类酶抑制剂：有两大类酶抑制剂：可逆抑制剂可逆抑制剂 不可逆抑制剂不可逆抑制剂691.竞争性抑制竞争性抑制():E +S ES E +P +Ki E2.反竞争性

49、抑制反竞争性抑制():E +S ES E +P +Ki ES Ki=E*I/EI,Eo=E+EI+ESEo=E+ESI+ES70():E +S ES E +P +Ki +Ki E ES +S作业：推导三种抑制下的米氏方程作业：推导三种抑制下的米氏方程71在可逆抑制剂存在条件下，酶反应系统中可能进在可逆抑制剂存在条件下，酶反应系统中可能进行以下反应：行以下反应：E+S ES E+P E+I EI EI+S EIS EI+P ES+I ESI EI+P简单情况下，简单情况下，=0，此时总的反应速度仍取决，此时总的反应速度仍取决于于k0和和ES，vi=k0ES。Ksk0KiKsK0KiK0K072由

50、于抑制剂的存在，由于抑制剂的存在，ES受多种因素的影受多种因素的影响，代数法或图像法可解出这个响，代数法或图像法可解出这个ES，总，总的动力学方程为：的动力学方程为：根据可逆抑制剂、底物和酶三者的关系，可逆抑制被分根据可逆抑制剂、底物和酶三者的关系，可逆抑制被分为三种类型：（完全型）竞争性抑制（为三种类型：（完全型）竞争性抑制（fully competitive inhibition）、（完全型）非竞争性抑制）、（完全型）非竞争性抑制（fully noncompetitive inhibition）和反竞争抑制）和反竞争抑制（uncompetitive inhibition）。）。Vv=1+K