专题基因工程基本操作程序课件.ppt

1、返回返回返回 1获取目的基因的常用方法有：从基因文库获取目的基因的常用方法有：从基因文库 中获取目的基因和利用中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基技术扩增目的基 因。因。2基因表达载体的构建是实施基因工程的基因表达载体的构建是实施基因工程的 第二步，也是基因工程的核心。第二步，也是基因工程的核心。3一个基因表达载体的组成，除了目的基因一个基因表达载体的组成，除了目的基因 外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。4将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花 粉管通道法。粉管通道法。

2、5培育转基因动物时，受体细胞一般是受精卵，目的基因的导入方培育转基因动物时，受体细胞一般是受精卵，目的基因的导入方 法常用显微注射技术。法常用显微注射技术。6检测目的基因是否导入和转录，常用分子杂交技术；检测是否翻检测目的基因是否导入和转录，常用分子杂交技术；检测是否翻 译，常用抗原译，常用抗原抗体杂交技术。抗体杂交技术。返回返回自读教材自读教材夯根底夯根底 1目的基因目的基因 (1)主要是指主要是指 的基因。的基因。(2)也可以是一些具有也可以是一些具有 的因子。的因子。2获取方法获取方法 (1)从基因文库中获取：从基因文库中获取：基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许基因文库的含义：将

3、含有某种生物不同基因的许多多 ，导入，导入 的群体中储存，各个受体菌分别含的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。有这种生物的不同的基因。编码蛋白质编码蛋白质调控作用调控作用DNA片段片段受体菌受体菌返回(2)利用利用PCR技术扩增目的基因：技术扩增目的基因：原理：原理：。前提条件：有一段目的基因的前提条件：有一段目的基因的 ，以便根据，以便根据这一序列合成这一序列合成 。条件：条件：DNA模板、模板、和和4种脱氧核种脱氧核苷酸。苷酸。DNA复制复制核苷酸序列核苷酸序列引物引物热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶引物引物返回扩增过程：扩增过程：受热受热引物引物热稳定热稳定DNA聚合酶聚

4、合酶3返回 1探讨基因文库、基因组文库、探讨基因文库、基因组文库、cDNA文库之间的关系。文库之间的关系。提示：基因组文库含有一种生物的全部基因，而提示：基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文文库只含有一种生物的局部基因，二者都是基因文库。库只含有一种生物的局部基因，二者都是基因文库。2从酶的角度分析从酶的角度分析PCR技术扩增技术扩增DNA与与DNA体内复制的体内复制的不同点。不同点。提示：提示：PCR技术扩增技术扩增DNA不需要解旋酶；不需要解旋酶；PCR技术需技术需要的要的DNA聚合酶应具有热稳定性。聚合酶应具有热稳定性。返回跟随名师跟随名师解疑难解疑难1提取目的基因方法的比较提

5、取目的基因方法的比较方方法法基因文库的构建基因文库的构建PCR技术技术扩增扩增人工合成人工合成基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库(如如cDNA文库文库)过过程程供体细胞中的供体细胞中的DNA 限制酶限制酶许多许多DNA片段片段 连接连接表达载体表达载体 导入导入受体细胞受体细胞 外源外源DNA扩增，产生扩增，产生特定性状特定性状 分离分离目的基因目的基因目的基因的目的基因的mRNA 反转录反转录单链单链DNA 合成合成双链双链DNA 插入插入载体载体 导入导入受体菌群受体菌群(cDNA文库文库)分离分离目的基因目的基因目的基因目的基因DNA 高温高温 解链解链单链单链DNA 与引与引

6、 物结合物结合 、DNADNA 聚合聚合 酶酶大量目大量目的基因的基因蛋白质的氨蛋白质的氨基酸序列基酸序列 推测推测mRNA的核的核苷酸序列苷酸序列 推测推测基因的核基因的核苷酸序列苷酸序列 化学化学 合成合成目的基因目的基因返回方方法法基因文库的构建基因文库的构建PCR技术技术扩增扩增人工合成人工合成基因组文库基因组文库部分基因文部分基因文库库(如如cDNA文库文库)优优点点操作简单操作简单专一性强专一性强可在短时可在短时间内大量间内大量扩增目的扩增目的基因基因专一性强，专一性强，可产生自然可产生自然界中不存在界中不存在的新基因的新基因缺缺点点工作量大、工作量大、盲目性大、盲目性大、专一性差

7、专一性差操作过程较麻操作过程较麻烦，技术要求烦，技术要求过高过高需要严格需要严格控制温度，控制温度，技术要求技术要求高高适用范围小适用范围小返回2PCR技术与生物体内技术与生物体内DNA复制的比较复制的比较DNA复制复制PCR技术技术区区别别解旋解旋方式方式解旋酶催化解旋酶催化DNA在高温作用下变性解旋在高温作用下变性解旋场所场所细胞内细胞内(主要在细胞核内主要在细胞核内)细胞外细胞外(主要在主要在PCR扩增仪内扩增仪内)酶酶DNA解旋酶、普通的解旋酶、普通的DNA聚合聚合酶等酶等耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶(Taq聚合酶聚合酶)温度温度条件条件细胞内温和条件细胞内温和条件需控制温度，在较高

8、温度下进行需控制温度，在较高温度下进行合成合成的对的对象象DNA分子分子DNA片段或基因片段或基因联系联系模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成原料：均为四种脱氧核苷酸原料：均为四种脱氧核苷酸酶：均需要酶：均需要DNA聚合酶进行催化聚合酶进行催化引物：均需要引物，使引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的聚合酶从引物的3端开始连接脱氧端开始连接脱氧核苷酸核苷酸返回 特别提醒特别提醒 (1)基因工程操作中，只有使用受体生物自身基因的启基因工程操作中，只有使用受体生物自身基因的启动子才比较有利于基因的表达。动子才比较有利于基因的表达。(2)通过通过

9、cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞中无法转录。编码序列导入受体细胞中无法转录。(3)热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶(Taq聚合酶聚合酶)能在高温下保持其能在高温下保持其活性，是活性，是PCR技术关键的工具之一。技术关键的工具之一。返回自读教材自读教材夯根底夯根底 1基因表达载体的构建基因表达载体的构建 (1)目的：使目的基因在受体细胞中目的：使目的基因在受体细胞中 ，并且可以，并且可以遗传和遗传和 。(2)组成：组成：稳定存在稳定存在表达表达返回 2将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 (1)导入植物细胞的方法：导入植物细胞

10、的方法：TDNA双子叶植物双子叶植物裸子裸子 ：常用于单子叶植物。：常用于单子叶植物。花粉管通道法：目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。花粉管通道法：目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。(2)导入动物细胞：导入动物细胞：方法：方法：技术。技术。常用受体细胞：常用受体细胞：。植物植物基因枪法基因枪法显微注射显微注射受精卵受精卵返回 (3)导入微生物细胞：导入微生物细胞：原核生物特点：原核生物特点：、多为、多为 、遗传物质、遗传物质相对相对 等。等。方法：感受态细胞法，即用方法：感受态细胞法，即用 处理细胞，使细处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态

11、分子的生理状态(这种细这种细胞称为胞称为 )。繁殖快繁殖快单细胞单细胞Ca2较少较少感受态细胞感受态细胞返回 1思考基因表达载体的构建需要哪些工具酶。思考基因表达载体的构建需要哪些工具酶。提示：提示：限制酶、限制酶、DNA连接酶。连接酶。2结合教材结合教材P13资料卡分析，用花粉管通道法导入受体细资料卡分析，用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。提示：提示：需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。3为什

12、么动物的体细胞不能作为受体细胞？为什么动物的体细胞不能作为受体细胞？提示：提示：动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体。体。返回跟随名师跟随名师解疑难解疑难 1基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程 将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再参加适量将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再参加适量DNA连接酶，形成一个重组连接酶，形成一个重组DNA分子分子(重组质粒重组质粒)。构建过程如。构建过程如下图：下图：返回2将目的基因导入受体细胞的方法比较将目的基因导入受体细胞的方法比较受体受体细胞细胞植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微

13、生物细胞常用常用方法方法农杆菌转化法、基因枪农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法法、花粉管通道法显微注射技术显微注射技术感受态细胞法感受态细胞法受体受体细胞细胞体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞转化转化过程过程以农杆菌转化法为例：以农杆菌转化法为例：将目的基因插入将目的基因插入Ti质粒质粒的的TDNA上上转入农杆菌中转入农杆菌中导入植物细胞导入植物细胞整合到受体细胞的整合到受体细胞的DNA上上提纯含目的基提纯含目的基因的表达载体因的表达载体显微注射显微注射受精卵发育受精卵发育具有新性具有新性状的个体状的个体Ca2处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞基因表达载体与基因表达载体与感受态细胞混

14、合感受态细胞混合感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNA分子分子返回 特别提醒特别提醒 (1)完成基因表达载体的构建，需要限制性核酸内切酶和完成基因表达载体的构建，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，连接产物有目的基因连接酶，连接产物有目的基因目的基因，目的基因目的基因，目的基因运运载体和运载体载体和运载体运载体三种。运载体三种。(2)将基因表达载体将基因表达载体(重组质粒重组质粒)导入农杆菌的常用方法是导入农杆菌的常用方法是Ca2处理法。处理法。Ca2(或或CaCl2溶液溶液)对微生物细胞的作用是增加对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。细胞壁的通透性。返回自读教材自读教材夯根底夯根底1分子水平

15、的检测分子水平的检测(连线连线)2个体水平的鉴定个体水平的鉴定(1)的接种实验。的接种实验。(2)对基因工程产品与天然产品的功能进展对基因工程产品与天然产品的功能进展 。抗虫或抗病抗虫或抗病活性比较活性比较返回 1检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？是什么？提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。2DNA分子杂交的原理是什么？有哪些应用？分子杂交的原理是什么？有哪些应用？提示：碱基互补配对原那么。可用于亲子鉴定、刑事侦查、提示：碱基互补配对原那么。可用于亲子鉴定、刑事侦查、生物亲缘关

16、系确定等。生物亲缘关系确定等。返回跟随名师跟随名师解疑难解疑难 目的基因的检测与鉴定归纳目的基因的检测与鉴定归纳返回返回 例例1为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。以下图是获取植基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。以下图是获取植酸酶基因的流程。酸酶基因的流程。返回 据图答复：据图答复：(1)图中基因组文库图中基因组文库_(填填“小于小于“等于或等于或“大于大于)cDNA文库。文库。(2)B过程需要的酶是过程需要的酶是_；A、C过程中过程中_(填填“可以或可以或“不可以不可以)使用同一种探针筛选含目的

17、基因的菌株。使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。(3)目的基因目的基因和和除可从构建的文库中别离外，还可以分除可从构建的文库中别离外，还可以分别利用图中别利用图中_和和_为模板直接进展为模板直接进展PCR扩增，扩增，该过程中所用酶的显著特点是该过程中所用酶的显著特点是_。思路点拨思路点拨返回 精讲精析精讲精析分析获取植酸酶基因的流程图可知，图中分析获取植酸酶基因的流程图可知，图中基因组文库大于基因组文库大于cDNA文库。文库。B过程需要的酶应该是逆转录酶；过程需要的酶应该是逆转录酶；A、C过程虽然都能获得含目的基因的菌株，但过程虽然都能获得含目的基因的菌株，但C中无内含子中无内含子对应的序列，

18、所以不可以使用同一种探针进展筛选。目的基对应的序列，所以不可以使用同一种探针进展筛选。目的基因因和和除可从构建的文库中别离外，还可以分别利用图中除可从构建的文库中别离外，还可以分别利用图中DNA和和cDNA为模板直接进展为模板直接进展PCR扩增，该过程中所用酶的扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。显著特点是耐高温。答案答案(1)大于大于 (2)逆转录酶不可以逆转录酶不可以 (3)DNAcDNA耐高温耐高温 返回 (2)表达：只有编码区能转录生成表达：只有编码区能转录生成RNA，且内含子转录的，且内含子转录的局部要剪切掉，即转录生成的局部要剪切掉，即转录生成的mRNA只有外显子对应局部。因只

19、有外显子对应局部。因此，以此，以mRNA为模板，逆转录产生的目的基因中没有内含子、为模板，逆转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。启动子和终止子。返回以下关于以下关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的选项是文库和基因组文库的说法中，不正确的选项是()AcDNA文库中的文库中的DNA来源于来源于mRNA的反转录过程的反转录过程B如果某种生物的如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因与该生物的基因组 文库中的某个基因控制的性状一样，那么这两个基因的构造文库中的某个基因控制的性状一样，那么这两个基因的构造 也完全一样也完全一样CcDNA文库中的基因都没

20、有启动子文库中的基因都没有启动子D一种生物的一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一文库可以有许多种，但基因组文库只有一 种种解析：由于基因转录时只有编码区段才能转录，所以以解析：由于基因转录时只有编码区段才能转录，所以以mRNA反反转录成的转录成的DNA就只有外显子区段，而缺少内含子和启动子等非编就只有外显子区段，而缺少内含子和启动子等非编码区段，和原来的基因构造不一样。码区段，和原来的基因构造不一样。答案：答案：B.返回 例例2右图为某种质粒表达载体简图，右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoR、BamH的酶切位点，

21、的酶切位点，ampr为青霉素抗性基为青霉素抗性基因，因，tetr为四环素抗性基因，为四环素抗性基因，P为启动子，为启动子，T为为终止子，终止子，ori为复制原点。目的基因的两端分别有包括为复制原点。目的基因的两端分别有包括EcoR、BamH在内的多种酶的酶切位点。在内的多种酶的酶切位点。返回 据图答复：据图答复：(1)将含有目的基因的将含有目的基因的DNA与质粒分别用与质粒分别用EcoR酶切，酶酶切，酶切产物用切产物用DNA连接酶进展连接后，其中由两个连接酶进展连接后，其中由两个DNA片段之间连片段之间连接形成的产物有接形成的产物有_、_、_三种。三种。(2)用上述用上述3种连接产物与无任何抗

22、药性的原核宿主细胞进种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进展转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，展转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有_；假设接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含假设接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有有的连接产物有_。返回 (3)目的基因表达时，目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是聚合酶识别和结合的位点是_，其合成的产物是，其合成的产物是_。(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒在酶切后产生在上述实验中，为了

23、防止目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_。思路点拨思路点拨返回 精讲精析精讲精析(1)将含有目的基因的将含有目的基因的DNA与质粒分别用与质粒分别用EcoR酶切，所产生的黏性末端一样，用酶切，所产生的黏性末端一样，用DNA连接酶处理后，连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成不同的片段随机结合，可形成3种不同的连接物：目的基因种不同的连接物：目的基因目的基因、目的基因目的基因、目的基因运载体、运载体运载体、运载体运载体。运载体。(2)在上述三种产物中，插入目的基因的都不能在四环素在上述三种产物中，插入目的基因的都不能在四环素培

24、养基上生长，只有运载体培养基上生长，只有运载体运载体连接产物才能在含四环运载体连接产物才能在含四环素的培养基上生长。素的培养基上生长。(3)启动子是启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可启动转录聚合酶识别和结合的位点，可启动转录过程，合成过程，合成mRNA。(4)由图示和题目中提供的信息可知，同时运用由图示和题目中提供的信息可知，同时运用EcoR和和BamH进展酶切可有效防止酶切后产生的末端发生任意进展酶切可有效防止酶切后产生的末端发生任意连接。连接。返回 答案答案(1)目的基因目的基因载体连接物载体载体连接物载体载体连接物载体连接物目的基因目的基因目的基因连接物目的基因连接物 (2)载体载

25、体载体连接物目的基因载体连接物目的基因载体连接物、载载体连接物、载体体载体连接物载体连接物 (3)启动子启动子mRNA (4)EcoR和和BamH返回 (1)切割目的基因和运载体时并非只能用一种酶，但无论切割目的基因和运载体时并非只能用一种酶，但无论用几种酶，一般都用一样种类的酶切割目的基因和运载体。用几种酶，一般都用一样种类的酶切割目的基因和运载体。(2)启动子启动子起始密码，终止子起始密码，终止子终止密码。终止密码。启动子和终止子位于基因构造的非编码区，起始密码和终止密启动子和终止子位于基因构造的非编码区，起始密码和终止密码位于码位于mRNA上。上。返回 例例3农杆菌是一种在土壤中生活的微

26、生物，能在自然条农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。下件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。下面是农杆菌转化法的示意图，试答复以下问题：面是农杆菌转化法的示意图，试答复以下问题：返回 (1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是一般情况下农杆菌不能感染的植物是_，利用农，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现_。具体原理是在农杆。具体原理是在农杆菌的菌的Ti质粒存在质粒存在TDNA片段，它具有可转移到受体细胞并整合片段，它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的到受体细胞的_上的特点，因此

27、只要将携带外源基因的上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到片段插入到_(部位部位)内部即可。内部即可。(2)根据根据TDNA这一转移特点，猜测该这一转移特点，猜测该DNA片段上可能含片段上可能含有控制有控制_(酶酶)合成的基因。合成的基因。(3)图中图中c过程中，能促进农杆菌移向植物细胞的物质是过程中，能促进农杆菌移向植物细胞的物质是_类化合物。类化合物。返回 (4)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外，还可采取的方法是杆菌转化法之外，还可采取的方法是_。(至少写出两种至少写出两种)思路点拨思路点拨 精讲精析

28、精讲精析(1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物，利用其感染性，可实现将目的可感染双子叶植物和裸子植物，利用其感染性，可实现将目的基因导入植物细胞。这里需要特别明确的是真正可转移到受体基因导入植物细胞。这里需要特别明确的是真正可转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体上的是农杆菌质粒上的细胞并整合到受体细胞的染色体上的是农杆菌质粒上的TDNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能导入成功。片段，因此目的基因必须插入到该部位才能导入成功。返回 (2)根据根据TDNA这一转移特点，可以推测出这一转移特点，可以推测出DNA片段上能片段

29、上能控制合成控制合成DNA连接酶、限制酶才能实现与双子叶植物细胞染色连接酶、限制酶才能实现与双子叶植物细胞染色体体DNA的整合。的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类化合物，促进农杆菌向植物植物细胞受伤后可产生酚类化合物，促进农杆菌向植物细胞转移。细胞转移。(4)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法。杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法。答案答案(1)单子叶植物将目的基因导入到植物细胞染单子叶植物将目的基因导入到植物细胞染色体色体DNATDNA片段片段(内部内部)(2)DNA连接酶、限制

30、酶连接酶、限制酶 (3)酚酚(4)基因枪法、花粉管通道法基因枪法、花粉管通道法返回 (1)在基因工程的操作中，只有第三步在基因工程的操作中，只有第三步“将目的基因导入受将目的基因导入受体细胞没有发生碱基互补配对，其余三步中都涉及碱基互补体细胞没有发生碱基互补配对，其余三步中都涉及碱基互补配对。配对。(2)在在DNA分子、分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是用放射性同位素等标记的含的基因是否转录时，用的探针都是用放射性同位素等标记的含有目的基因的有目的基因的DNA片段。片段。返回Thank You世界触手可及世界触手可及携手共进，齐创精品工程携手共进，齐创精品工程