三基因工程载体课件.pptx

1、pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprEcoRI*EcoRI*pBR313pBR322(4.3Kb)pBR320(2.8Kb)pBR318（6.3Kb)去除两个PstIEcoRII片断去掉酶切酶切体外重组CAP protein binding site-591-554(compl.strand);mRNA(LacZ)starts at nt position 507(compl.strand);lac repressor bin

2、ding site-507-487(compl.strand).重组DNAAmprTcs提取DNA 电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化 无菌落阳性菌落筛选重组子2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切筛筛选选重重组组子子的的示示意意图图 BamHI片段片段(Tcr)pBR322PstI(Apr)片段片段 重组分子重组分子I 重组分子重组分子(Aps Tcr)(Apr Tcs）PstI片段片段 外源外源DNABamHI片段片段利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程重组分子重组分子I 涂布涂布Ap平板平板

3、Apr转化子转化子 分别转化分别转化E.coli(ApS TcS)重组分子重组分子 涂布涂布Tc平板平板 Tcr转化子转化子影印到影印到Tc平板上平板上 Apr TcS为重组子为重组子Apr Tcr为原载体为原载体 影印到影印到Ap平板上平板上 ApS Tcr为重组子为重组子 即为非重组子即为非重组子Multiple Cloning SitespUC18pUC19OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONNAprAprApr转化筛选重组子 白色菌落2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA重组DNA提取DNA 电泳AprAprApr1)限制酶切利利用用菌菌落落颜颜

4、色色筛筛选选重重组组子子T A AA T G I II III IV V I V I II VA T G I II III VIIIIIIO r i转 录 起 始 翻 译 起 始 信 号 肽 成 熟 蛋 白 质 转 录 终 止 区C SC SC SC S-clo n in g site三三种种表表达达型型载载体体结结构构图图1、克隆载体，全长、克隆载体，全长3.19kb，具有，具有Amp抗性基因和复制起始点抗性基因和复制起始点2、MCS两侧有两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子聚合酶启动子-可进行体外转录；可进行体外转录；为插入片段的测序提供特异引物位点为插入片段的测序提供特异引物位点3、MC

5、S为于为于lacZ基因内部（插入失活）基因内部（插入失活）蓝白斑筛选蓝白斑筛选4、引入丝状噬菌体、引入丝状噬菌体f1(+)复制起始点复制起始点-可以产生单链可以产生单链DNA，并，并分泌至上清中，分泌至上清中，分泌型融合表达载体，分泌型融合表达载体，有两个启动子有两个启动子（Plac,Pspa），启动），启动子下游装有子下游装有SPA的信号的信号肽序列和两个结构基因肽序列和两个结构基因ZZ。产生与。产生与SPA蛋白蛋白ZZ段融合的蛋白，并可段融合的蛋白，并可将融合蛋白分泌出胞将融合蛋白分泌出胞4.59kb，含，含Amp抗性抗性基因和原核复制起始点基因和原核复制起始点有有f1复制起始点，可产复制

6、起始点，可产生单链生单链DNAYEp247769 bps2 URA3TcoriAmprr 细胞外细胞内通过自然选择法筛选无EcoRI识别位点的-噬菌体 感染周期Coordinates of M13mp18/19 genes(termination codons included):I 3196-4242II 6849-831III 1579-2853IV 4220-5500V 843-1106VI 2856-3194VII 1108-1209VIII 1301-1522IX 1206-1304X 496-831M13mp18 M13mp19 pYAC4CEN4S up4URA3TELHis3T

7、E LoriAmpTRP1/ARS1His3oriAmprEcoR IBamH IBamH I11400 bps pBeloBAC117400 bpsoriSrepEparAparBparCCmrSal IcosNloxPNot INot Ilac ZBam HI Hind IIIT7SP6 结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End谢谢大家荣幸这一路，与你同行ItS An Honor To Walk With You All The Way演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日