[化学]核酸代谢课件.ppt

1、一、核酸的酶促降解一、核酸的酶促降解1.核酸水解：DNA 稳定，耐酸碱RNA 易水解：碱中水解2.酶促水解：RNA:RNase(酶稳定、耐高温)DNA:DNase(种类多、工具酶)作用类别：核酸内切酶 磷酸二酯酶 核酸外切酶 磷酸单酯酶非特异性特异性3.3.限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（Restriction endonucleaseRestriction endonuclease）具有识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶统称为限制性核酸内切酶 发现：1952，Smith Human 用T4 phage 感染E.coli.提出了限制与修饰现象。三字母：属名

2、种名株名类：内切、修饰，识别与切割位点不一致类：识别与切割位点统一类：切割方式基本同类核酸核苷碱基降解核苷酸Pi戊糖二、核苷酸的分解代谢二、核苷酸的分解代谢1.嘌呤碱的分解NNNHNNH2次黄嘌呤尿素NH3+CO2GRNH2（微生物）黄嘌呤 尿酸（醇式）2.嘧啶碱的分解NNHNH2ONHNHOONH2还原H2O（开环）-脲基丙酸H2O-丙氨酸HNNHOOCONHCH2CH2COOHH2NCO2NH3NH2CH2CH2COOH三、核苷酸的生物合成三、核苷酸的生物合成 概述：从头合成基本途径 半合成（补救合成）（CO2/NH3/AA/戊糖）核苷酸 dNDP分解的现成嘌呤、嘧啶ATP核苷酸合成的两条

3、途径核苷酸合成的两条途径核糖、氨基酸、CO2、NH3核糖核苷酸脱氧核苷酸辅酶RNA核苷碱基脱氧核苷DNA1.嘌呤核苷酸的合成NNC123547689CO2Asp一碳单位一碳单位Gln甘氨酸甘氨酸一碳单位一碳单位N5,N10-次甲基四氢叶酸次甲基四氢叶酸2.嘧啶核苷酸的合成CO2GlnAsp核酸的生物合成核酸的生物合成中心法则中心法则 生物的遗传信息从生物的遗传信息从 DNADNA传递给传递给 mRNAmRNA的过程称为转录。根据的过程称为转录。根据 mRNAmRNA链上的遗传信息合成蛋链上的遗传信息合成蛋 白质的过程，被称为翻译和白质的过程，被称为翻译和 表达。表达。19581958年年Cri

4、ckCrick将生物将生物 遗传信息的这种传递方式称为中心法则遗传信息的这种传递方式称为中心法则。Reverse transcription第一节第一节 DNA的生物合成的生物合成一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制 复制时期复制时期 1.半保留复制的证明半保留复制的证明2.DNA2.DNA生物合成的基本问题生物合成的基本问题模板模板引物引物dNTPdNTPDNADNA聚合酶聚合酶 MgMg2 2l在在5 5-3-3方向延伸方向延伸二、原核细胞二、原核细胞DNADNA的复制合成的复制合成 1.1.原核生物原核生物DNADNA聚合酶聚合酶2.2.复制的复杂性复制的复杂性 5533 酶作用

5、DNA聚合酶53聚合酶及外切酶作用，35外切酶酶作用，可校正/修复DNA链，还可切除引物DNA聚合酶53聚合酶及35外切酶酶作用，可校正/修复DNA链DNA聚合酶与酶作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶 replicase）l 冈崎片段与半不连续复制（冈崎片段与半不连续复制（okazaki 1968okazaki 1968年）年）l 复制方向：复制方向：单起点、双向或单向复制单起点、双向或单向复制l 引物（引物（primerprimer）及引物酶）及引物酶(primase)(primase)l 引物的切除与连接引物的切除与连接 5 53 3外切酶外切酶 切除引物切除引物 （DNADNA聚

6、合酶聚合酶）DNADNA连接酶连接酶 （大肠杆菌（大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶/T/T4 4连接酶）连接酶）l 复制的起始复制的起始 辨识起点（富含辨识起点（富含ATAT区）区）解旋（拓扑异构酶）解旋（拓扑异构酶）解链解链 单链结合蛋白（单链结合蛋白（SSBSSB）三、真核三、真核DNADNA的复制合成的复制合成真核生物真核生物DNA聚合酶聚合酶亚基数44425分子量（KD)25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核53聚合活性35外切活性功能复制、引发修复复制复制复制DNADNA复制过程复制过程真核生物真核生物DNADNA复制叉结构示意图复制叉结构示意图 1970

7、 1970年，年，TeminTemin和和BaltimoreBaltimore在致癌在致癌RNARNA病毒中发现病毒中发现了反转录酶（了反转录酶（Reverse TranscriptaseReverse Transcriptase）1.DNA1.DNA聚合酶特性聚合酶特性 需引物（需引物（tRNAtRNA）、）、dNTPdNTP、模板（、模板（RNARNA、DNADNA）、）、5 5-3-3方向聚合方向聚合 2.2.杂交分子杂交分子H H键断开键断开 常由核糖核苷酶常由核糖核苷酶H H（RNAase HRNAase H）专一切除）专一切除RNA-DNARNA-DNA分子中的分子中的RNA,RN

8、A,全部或部分去除全部或部分去除RNARNA 3.3.前病毒前病毒DNADNA 合成的合成的DNADNA链称负链链称负链,然后由依赖然后由依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶催化下聚合酶催化下,以负链为模板合成一正链以负链为模板合成一正链这样形成的这样形成的DNADNA称前病毒称前病毒DNA,DNA,前病毒前病毒DNADNA可嵌入宿主细胞可嵌入宿主细胞DNADNA中中(称整合称整合)或潜伏于或潜伏于宿主细胞用其负链宿主细胞用其负链(依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶)出出RNA,RNA,合成外壳蛋白合成外壳蛋白.1.1五、五、DNA的损伤与修复的损伤与修复 损伤可造成突变或致死

9、损伤可造成突变或致死 突变（突变（mutation）：）：指一种遗传状态，可以通过复制指一种遗传状态，可以通过复制而遗传的而遗传的DNA结构的任何永久性改变。携带突变基结构的任何永久性改变。携带突变基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。当当DNADNA受到大剂量紫外线（波长受到大剂量紫外线（波长260nm260nm附近）照射时，附近）照射时，可引起可引起DNADNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如成二聚体，例如TTTT二聚体。二聚体。2.DNA损伤修复损伤修复 光复活光复活 切除修复切除修复 重组修复

10、重组修复 SOS修复修复光复活（光复活（photoreactivation）可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。切除修复（切除修复（excision repair）即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。细胞的修复功能对于保护遗传物质DNA不受破坏有重要意义。重组修复（重组修复（recombination repair）又称复制后修复（postreplicati

11、on repair）受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。SOSSOS修复修复 指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-Prone Repair）。3.3.基因重组与基因重组与DNADNA克隆（基因工程）克隆（基因工程）能识别能识别DNADNA特定核苷酸序列的核酸内切酶特定核苷酸序列的核酸

12、内切酶分布：主要在微生物中。主要在微生物中。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。切割特定切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。产生黏性未端（碱基互补配对）。举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTCGAATTC序序列，并在列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。v一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有分子切断。目前已发现的限制酶有400400500500多种。多种。l DNADNA重组与克

13、隆重组与克隆PCR(polymerase Chain reaction)PCR(polymerase Chain reaction)聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然也称体外酶促基因扩增，原理类似天然DNADNA复制。靶复制。靶DNADNA分子变性后解链，分子变性后解链，两条单链两条单链DNADNA分别与两条引物互补结合，在分别与两条引物互补结合，在4 4种种dNTPdNTP存在和合适和条件下，存在和合适和条件下，由耐热的由耐热的Taq DNATaq DNA聚合酶催化引物由聚合酶催化引物由5 5 3 3 扩增延伸，形成两条新的双链扩增延伸，形成两条新的双

14、链DNADNA分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、复性、延伸循环，模分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、复性、延伸循环，模板板DNADNA增加一倍。经过增加一倍。经过30305050个循环，可使原个循环，可使原DNADNA量增加量增加106106109109倍。倍。模板DNA的变性 一般选用95左右1min，使DNA 双链解为单链 复性 按引物实际情况确定适当温度，时间一般30s至1.5min 延伸 一般72 1min 循环数 按初始模板浓度确定，一般2545之间 PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的设计是PCR成功的关键，引物位置和产物长度 根据不同目的和要求确定，长

15、度一般在200800bp之间 引物的长度 一般为1825bp 末端核苷酸 3端不得有任何修饰 GC含量和Tm值 一般在4060%之间，两条相差23 第二节第二节 RNARNA的生物合成的生物合成DNADNA携带的遗传信息（基因）携带的遗传信息（基因）传递给传递给RNARNA分子的过程称转分子的过程称转录（录（transcription）。）。在生物界，在生物界，RNARNA合成有两种方式：合成有两种方式：一是一是DNADNA指导的指导的RNARNA合成，此为生物体合成，此为生物体内的主要合成方式。另一种是内的主要合成方式。另一种是RNARNA指指导的导的RNARNA合成，此种方式常见于病毒。合

16、成，此种方式常见于病毒。转录产生的初级转录本是转录产生的初级转录本是RNARNA前体前体（RNA precursorRNA precursor），需经加工过程），需经加工过程（processingprocessing）方具有生物学活性。）方具有生物学活性。反应体系：反应体系：DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+，合成方向 53。连接方式-3,5磷酸二酯键。转录特点：转录特点：不对称转录-DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录不对称转录。模板链模板链(template strand)及反意义链及反意义链(antisense strand):指导R

17、NA合成的DNA链为模板链，又称反意义链。编码链编码链(coding strand)及有意义链及有意义链(sense strand)：不作为转录的另一条DNA链为编码链，又称有意义链。由于基因分布于不同的DNA单链中，即某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。原料：原料：四种磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中变为U 合成过程合成过程:连续，方向：方向：53从头合成,5末端的起始核苷酸常为GTP或ATP 不对称转录“转录单位”（transcription unit）以操纵子（operon）为转录的功能单位,结构上包括四个功能区：多顺反子（结构基因区）、启动子、操作子、

18、终止子和调节基因。原核RNA聚合酶 转录过程调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMPCAP-cAMP复合物复合物mRNAmRNA+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶 大肠杆菌的大肠杆菌的RNARNA聚合酶聚合酶 全酶由全酶由5 5种亚基种亚基2 2 组成组成，因子与其它部分的结合不是十因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与分紧密，它易于与2 2分离，分离，没有没有、亚基的酶称为核心酶亚基的酶称为核心酶只催化链的延长，对起始无作用。只催化链的延长，对起始无作用。五种亚基的功能分别为：五种亚基的功能分别为：亚基：与启动

19、子结合功能。亚基：与启动子结合功能。亚基：含催化部位，起催化作用，催化形亚基：含催化部位，起催化作用，催化形 成磷酸二酯键。成磷酸二酯键。亚基：在全酶中存在，功能不清楚。亚基：在全酶中存在，功能不清楚。亚基：与亚基：与DNADNA模板结合功能。模板结合功能。亚基：识别起始位点。亚基：识别起始位点。1.1.起始位点的识别起始位点的识别 识别正确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组识别正确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组成：成：-35-35序列提供了序列提供了RNARNA聚合酶全酶识别的信号；聚合酶全酶识别的信号；-10-10序列是序列是酶的紧密结合位点（富含酶的紧密结合位点（富含ATAT

20、碱基，利于双链打开）；第三碱基，利于双链打开）；第三部分是部分是RNARNA合成的起始点。合成的起始点。35+1转录起始点转录起始点AACTGTATATTATTGACATATAAT5335序列序列 Sextama 框框 10序列序列Pribnow框框 加入的第一个核苷三磷酸常是加入的第一个核苷三磷酸常是GTPGTP或或ATPATP。所形成的启动子、全酶和。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，到转录起始点，亚基就会被释放脱离核心酶。亚基就会被释放脱离核心酶。-35-10pppG

21、或pppA5 55 53 33 3模板链模板链E 3.3.链的延伸链的延伸 以NTP为原料和能量,DNA模板链为模板，靠核心酶的催化，核苷酸间通过3,5-磷酸二酯键成核糖核酸链(RNA)4.4.转录终止转录终止 转转录终止信号有两种情况录终止信号有两种情况 弱终止子：依赖弱终止子：依赖因子（终止因子，因子（终止因子，terminators）的终止的终止 NusANusA蛋白识别蛋白识别DNADNA链上的终止信号，在链上的终止信号，在因子帮助终止。因子帮助终止。强终止子：（强终止子：（1 1）在终止点之前具有一段富含）在终止点之前具有一段富含G-CG-C的回的回文区域。（文区域。（2 2）富含）

22、富含G-CG-C的区域之后是一连串的的区域之后是一连串的dAdA碱基序列，碱基序列，它们转录的它们转录的RNARNA链的末端为一连串链的末端为一连串U U（连续（连续6 6个）个）。三、真核生物的转录作用三、真核生物的转录作用酶类分布产物活性分子量(KDa)反应条件核仁核质核质rRNA（5.8S、18S、28S）mRNAtRNA、5SrRNA5070204010500700700低离子强度要求Mg2+或Mn2+高离子强度高Mn2+浓度1.1.真核真核RNARNA聚合酶聚合酶2.2.转录转录 真核真核RNARNA转录基本过程与原核类似，但其产生的转录基本过程与原核类似，但其产生的mRNAmRNA

23、为为“单顺反子单顺反子”，只编码，只编码一条肽链。一条肽链。四、转录过程的选择性抑制剂四、转录过程的选择性抑制剂 放线菌素放线菌素D D利福平利福平鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱原核原核抑制抑制抑制抑制不抑制不抑制真核真核抑制抑制不抑制不抑制抑制抑制RNARNA聚合酶聚合酶 在细胞内，由在细胞内，由RNARNA聚合酶合成的原初转录物（聚合酶合成的原初转录物（primary transcriptprimary transcript）往往）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、需要一系列的变化，包括链的裂解、5 5 和和3 3 末端的切除和特殊结构的形成、核末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等

24、过程，才转变为成熟的苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNARNA分子。此过程总称为分子。此过程总称为RNARNA的成熟或称为的成熟或称为RNARNA的转录后加工。的转录后加工。原核生物的原核生物的mRNAmRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。短）。rRNA前体的转录后加工前体的转录后加工tRNA前体的加工前体的加工真核真核mRNA前体的加工前体的加工 rRNArRNA前体的加工前体的加工 r rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列。加工过程：加工过程：1、剪切作用：需核酸酶参与。2、甲基化修饰：修饰在碱

25、基上。3、自我剪接：一种核酶的作用。原核原核rRNArRNA加工：加工：rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA 真核真核rRNArRNA加工：加工：1.5S自成体系加工少无修饰和剪接。2.45S加工中含剪切和甲基化修饰，需核酸酶。大肠杆菌rRNA前体加工真核生物rRNA前体加工 tRNAtRNA前体的加工前体的加工 tRNAtRNA前体在前体在tRNAtRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNAtRNA分子分子 3 3末端加上末端加上CCACCA 碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用l 真核真核mRNAmRNA前体的加工前体

26、的加工 剪接（剪接（SplicingSplicing）去除内含子，连接外显子 5 5帽端结构的生成（如图）帽端结构的生成（如图）3 3端多聚端多聚A A（polyApolyA）的附加）的附加六、六、RNARNA的复制合成（的复制合成（RNARNA指导的指导的RNARNA合成）合成）噬菌体噬菌体QQ的的RNARNA复制两阶段复制两阶段（1 1）其单链）其单链RNARNA可充当可充当mRNAmRNA，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白和白和RNARNA复制酶的复制酶的亚基。亚基。（2 2）复制酶的）复制酶的亚基可与来自寄主细胞的亚基亚基可与来自寄主细胞的亚基 自动装配自动

27、装配成成RNARNA复制酶，可进行复制酶，可进行RNARNA的复制，以分子中单链的复制，以分子中单链RNARNA为模板为模板（正链），复制出一条新的（正链），复制出一条新的RNARNA链（负链），再复制出正链，链（负链），再复制出正链，与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。某些某些RNARNA病毒可以以自身病毒可以以自身RNARNA为模板进行复制。为模板进行复制。不同的不同的RNARNA病毒复制方式不同病毒复制方式不同5 RNA-5 3 3 RNA+释放释放释放释放35 3 3 5 5 RNA+RNA+RNA-vRNA-及及 RNA+的合成方向均为的合成方向均为5 3

28、核酶核酶 1982年Cech发现四膜虫rRNA前体自我剪接作用，RNA有催化作用;1983年发现RNase P中的RNA可催化tRNA前体的加工。核酶我切割区内有锤头结构核酶我切割区内有锤头结构（hammer-head structure），其中的结构特点是：（1）三个茎区形成局部的双链结构；其中含13个保守的核苷酸，N代表任何核苷酸。（2）图中的箭头表示自我切割位点，位于GUX的X外侧，X可表示为C、U或A，不能是G。核酶的生物学意义核酶的生物学意义 1.RNA为生物催化剂，具有重要生物学意义。2.打破了酶是蛋白质的传统观念。3.在生命起源问题上，为先有核酸提供了依据。4.为治疗破坏有害基因，肿瘤等疾病提供手段。