USP微生物检测精要课件.ppt

1、USP微生物检测精要微生物检测精要 主讲人：USP概述世界上唯一的非政府药典机构世界上唯一的非政府药典机构独立、非盈利、自主（无外部资助）独立、非盈利、自主（无外部资助）收入来源于销售收入来源于销售-参考标准品参考标准品-USP出版物和相关产品出版物和相关产品标准被多个国家认可标准被多个国家认可业界、学术界和政府的志愿者参与标准制定业界、学术界和政府的志愿者参与标准制定 标准设定参与者得广泛性标准设定参与者得广泛性USP概述使命建立有助于提高药品和食品质量、安全性和效用的公共标准及相关方案，以改善全世界人民的公共健康。USP概述USP与法律如果一个产品或器械声称或将其描述为官方药典中已认可的药

2、物，但是其效力与药典标准不符，或其质量或纯度低于药典标准，将被认为是次级品。（联邦食品、药品、化妆品法案 第501（b）章节）USP概述 USP微生物学内容与其总的使命一致，USP在微生物学方面的角色是，在微生物方面连同其他要求来发展公共标准，保证产品质量的一致性药品、辅料和原料药。USP概述无菌控制也适用于非无菌产品控制贯穿于一个药物或生物制剂从研发到市场到成品控制的整个过程整个过程中的各种微生物控制的整合将提高最终产品微生物质量的保证USP提供了每个阶段微生物控制的程序和指导微生物学是开发、生产及成品测试的一部分USP概述作为重要组成的微生物控制原料和组分的微生物控制环境的微生物控制生产过

3、程的微生物控制成品的微生物控制所有微生物控制的整合人员的微生物控制USP概述原料和组分的微生物控制的USP观点及文件非无菌产品的微生物检查：微生物计数测试非无菌产品的微生物检查：控制菌检查非无菌药品的微生物评估USP概述环境微生物控制的USP观点及文件洁净室和其他受控环境的微生物评估消毒剂与杀菌剂无菌测试隔离系统验证USP概述过程微生物控制的USP观点及文件灭菌与无菌保证生物指示剂灭菌化学和物理化学指示剂，及综合指示剂生物指示剂耐受力测试USP概述成品微生物控制的USP观点及文件无菌测试细菌内毒素测试热原测试抗菌有效性测试最终灭菌药品参数放行无菌产品包装完整性评估 微生物实验室规范 微生物实验

4、室规范重要的控制点无菌技术培养基控制菌种控制设备控制实验室布局和运作数据文件控制员工培训 微生物实验室规范无菌技术防止和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作方法和管理方法无菌环境灭菌消毒卫生要求无菌操作技术 微生物实验室规范培养基微生物实验室工作质量的核心是培养基，应根据既定的目的选用正确的培养基。生产商应提供相关的CoA和说明书配制储存菌种选用水纯化水，去离子水，蒸馏水记录用量成分的测量校准过的天平，天平的量程应准确清洁的容器和工具记录称量 微生物实验室规范培养基不要过度加热加热帮助溶解，通常培养基变深说明过度加热添加剂加入后需充分混合清洁的玻璃器皿防止外来污染和抑菌剂玻璃器皿清洁 微生物实

5、验室规范培养基灭菌条件供应商提供参数，或自己验证高压蒸汽灭菌，过滤除菌验证应考虑无菌和培养基生长能力湿热灭菌要考虑装载分布，通常121 15min 微生物实验室规范培养基灭菌条件在无菌和过度加热之间平衡消毒锅灭菌结束后，不建议在其中存储培养基不正确的加热、灭菌条件会影响培养基的 颜色 澄清度 pH 凝固能力 促生长能力 选择性 微生物实验室规范培养基储存制备培养基的储存，注意低于0，凝胶结构破坏避光 避热琼脂培养基密封 融化重复融化应被限制（不超过一次），防止过度加热或潜在污染融化时，使用 水浴或流通蒸汽 微波炉，热板要防止过度加热融化的培养基储存 在4045水浴不应超过8小时 浇制平皿前擦干

6、 微生物实验室规范培养基储存培养基应标示批号，制备批号制备日期，有效期培养基名称有效期确定根据成分，配方，容器，储存条件等确定生长能力试验数据支持 微生物实验室规范培养基储存培养基应根据生产商的说明书，并在验证过的条件下储存培养基储存不得超过有效期重要区域环控用培养基必须双层包装最终灭菌，否则进行全数预培养及用前检查 微生物实验室规范培养基质控测试所有待用的培养基应检查：生长能力 每批制备的培养基均需进行 测试菌种根据药典，供应商说明及环境中分离得到的菌株 生长能力测试不合格 调查 不得使用该批号无菌pH，0.2容器/平皿的完整性抑制或指示能力定期稳定性检查以确认储存效期 微生物实验室规范微生

7、物菌种保藏建立标准程序处理、保存菌种。防止污染和特性变化必须小心地处理使用前确认菌种的身份，纯度根据生产商说明书复苏菌种，使用接种技术-70以下或冷冻干燥保存储备菌种，可延长保存周期开启后不要重新冷冻菌种追溯传代次数，不超过五代 微生物实验室规范实验室设备维护绝大部分实验室设备需要进行标准的验证（IQ、OQ、PQ）定期校准、保养定期进行性能检查根据设备的特性和使用状况确定频率定期清洁、消毒 微生物实验室规范实验室布局和运作实验室布局应该有利于实验室运作 防止交叉污染 活动分区 无菌、环控样品的处理和培养应在无菌环境中进行 注意安全实验室应通过不同的进入通路和隔断来区分“洁净”区和“阳性”区，包

8、括更衣，清洁，消毒，洁净区的生物安全柜仅用于无菌和洁净的操作当样品发现微生物生长，后续的工作应转移至“阳性”区 微生物实验室规范实验室布局和运作在无菌条件下小心地对物料进行取样环控培养基应在待取样区域环境中放入环控设备并小心的操作无菌隔离装置技术的使用可能是有效的微生物实验室规范样品处理大部分样品，水或环控样品中的微生物对操作、储存环境敏感。产品处方、容器材质、储存时间/温度减少样品，取样与测试间的间隔时间，并控制储存条件。远距离的转移需确认转移条件对测试及样品的影响。可能的话，在无菌条件下，使用无菌技术取样，即使是非无菌样品。取样记录 样品信息、取样日期、送样日期、人员/部门，实验室样品，接

9、受及确认微生物实验室规范培养基培养时间培养时间短于3天，用小时表示3035培养1872小时培养指定的最短时间，当超过培养时间时，进行良好的微生物结果判断培养时间长于3天，用天表示3035培养35天从上午或下午，培养至结束当天的相同时间段，进行结果判断微生物实验室规范人员培训制药企业微生物实验室人员应该接受过微生物学或相关健康科学的正规学习（在校学习）相关SOP的培训被赋予保持其技术和经验的职责程序SOP应易于理解并作为培训计划的基础SOP的编号或标题提供了一个便利的将培训文件化方法每个岗位应有相应培训要求，进行上岗前资质确认微生物实验室规范人员培训绩效评估应定期进行应证明人员在实验室核心活动中

10、的能力微生物实验室管理人员应经过适当的教育和培训管理、计划、预算、安全、调查技巧、技术报告编写、相关SOP等微生物技术水平应不低于其管理的技术人员了解微生物学原则、能科学地解释法规及指南有足够的微生物知识与经验提供技术指导微生物实验室规范实验室资源管理层保证实验室有足够的资源完成要求的测试熟悉预算管理制定实验室绩效考核指标微生物实验室规范文件实验室文件至少包括：微生物人员培训和能力确认（上岗资质）设备验证、校准和维护测试中的设备性能（如温度记录）培养基制备、无菌检查、生长能力测试、选择性能力培养基清单与控制根据程序进行测试的重要参数数据和计算的确认经QA人员或相应领导审核过的报告超标调查结果微

11、生物实验室规范实验室结果的维护记录重要的测试步骤及参数，用以确认结果的完整性，并为能重复测试提供信息至少应包括日期测试样品微生物检验人员名字程序编号测试结果偏差（如有）测试参数(设备，菌种，培养基)管理人员审核签名微生物实验室规范实验室结果的维护设备重要设备记录在测试记录上校准计划适用的话，有使用记录重要的温度记录（水浴，培养箱，灭菌锅）应该具溯源性数据纠错错误的地方划一横线，签名和日期微生物实验室规范实验室结果的维护测试结果应包含平皿计数结果（如有）数据分析的方法应罗列在相关的SOP中对粘贴的图表、数据，骑缝签名存档记录应存档并防止丢失应有记录保存计划微生物实验室规范测试结果解释微生物数据有

12、时不容易解释与人类相关的微生物群落被广泛的用于许多测试人员污染是始终被关心的问题样品或环境中的微生物并非均匀分布微生物检测可变范围大：可能在+/-0.5log10单位左右因此，得到的结果与期望的结果略有差异并不是重大问题。微生物实验室规范测试结果解释避免污染非常重要结果必须从广泛的微生物角度去解释：可能的污染物的情况产品中微生物存活的可能微生物生长特性（尤其是真菌孢子的散布，生长）微生物实验室规范测试结果解释对不合格结果进行调查通常会发现，不合格由以下2个原因中的一个造成。实验室错误产品不合格无论哪种情况，管理层必须立即被通知微生物实验室规范测试结果解释纠偏计划如果发现实验室错误，需要纠偏措施

13、的有效性需要跟踪和记录无效测试由于错误将试验结果视作无效必须记录确认测试（复试）应有SOP描述何时进行确认测试药物制剂和药用物质的接受标准介绍非无菌制剂中存在的微生物可能降低产品的治疗作用，甚至使之失活，并可能对病人健康产生不良影响。生产商必须按GMP的指导进行制剂产品的生产储存和分发，以保证最终制剂仅带有低水平的微生物。药物制剂和药用物质的接受标准介绍非无菌产品的微生物检查根据非无菌产品的微生物检查：微生物计数和非无菌产品的微生物检查：控制微生物测试正文中的方法进行。药物制剂和药用物质的接受标准剂型TAMC（cfu/g or mL）TCYMC（cfu/g or mL）无控制微生物（1g or

14、 mL）口服固体1000100大肠口服液体10010大肠直肠制剂1000100局部及鼻腔制剂10010金黄 铜绿阴道制剂10010金黄 铜绿白念吸入剂10010金黄 铜绿耐胆盐G-非无菌制剂的微生物质量标准药物制剂和药用物质的接受标准剂型TAMC（cfu/g or mL）TCYMC（cfu/g or mL）无控制微生物（1g or mL）部分药物成分，辅料1000100_非无菌原料的微生物质量标准药物制剂和药用物质的接受标准除了表中的微生物，其他需检查的微生物的重要性应根据下述评估：产品用途（眼，鼻，等）产品特点：支持生长吗？或有防腐性应用的方法药物接受者：对婴儿、幼儿及衰弱患者的风险是不同的

15、存在疾病、伤口、器官损伤相应因素的风险评估由经授权的有资质的人员进行。药物制剂和药用物质的接受标准适当的书面程序必须建立并遵循以防止非无菌药品中的有害微生物。不仅仅是不存在USP规定的微生物药物制剂和药用物质的接受标准有害微生物有害微生物的概念不适用于无菌产品。将用于非无菌产品的微生物测试，及非无菌生产环境中分离到的微生物评估及清洁验证。药物制剂和药用物质的接受标准有害微生物可以被定义为：1.能在产品中增殖的微生物，对药品的物理特性及治疗作用有负面影响2.由于产品中微生物的数量及致病性能导致使用该药品的患者受到感染药物制剂和药用物质的接受标准有害微生物：洋葱伯克氏菌需氧的非芽孢杆菌。存在于水中

16、，土壤及植物中，如水果和蔬菜。伯克氏菌属中有两种常见人体致病菌，洋葱伯克氏菌及类鼻疽伯克氏菌。洋葱伯克氏菌是患有囊肿性纤维化和慢性肉芽肿疾病的患者体内重要的呼吸道致病菌。以前属于假单胞菌菌属。药物制剂和药用物质的接受标准有害微生物：铜绿假单胞菌考虑到其感染数量和感染类型，及有关的发病率和死亡率，它是假单胞菌属中最重要的人体致病菌。这些细菌引起的疾病范围从表皮感染到爆发性坏血症。铜绿假单胞菌是医院感染主因。它是医院呼吸道感染的首要原因，对于加护病房插管治疗的病人危害极大，死亡率达40%到50%。几年前，铜绿假单胞菌被认为是小儿及成人艾滋病患者发病和死亡的重要原因。药物制剂和药用物质的接受标准US

17、P微生物质量接受标准USP各论要求是最低的公共标准通则提供了符合各论要求的方法有效期内测试不等于成品所需的所有放行测试水分活性水分活性Aw产品中水的蒸汽压P对相同温度下纯水中的蒸汽压P0的比率。它在数字上等于密闭系统中产品产生的相对湿度的1/100它是物料中游离态的水分的测量。注意：水分活性水分含量水分活性为什么水分活性对微生物生长重要呢？1.微生物需要产品中游离态的水进行增殖2.水分活性测定是比水分含量测定更好的对游离水的测定，而不是对结合水，微生物细胞需要游离水进行代谢活动及渗透压调节水分活性降低水分活性在微生物生长方面的作用：1.较长的停滞期、较慢的生长速度、较少的稳定期的生物数量水分活

18、性降低水分活性在微生物生长方面的作用：2.较少微生物毒素的产生3.在某个微生物专有的水分活性以下，该微生物不会生长4.然而，水分活性下降后，微生物的耐热性会提高水分活性非无菌药物制剂中水分活性的确定可以帮助作出以下的相应决定：1.改善产品处方以提高防腐系统的抗菌效力；2.降低可能在产品处方中化学水解的活性成分的降解；3.降低微生物对产品的污染，并提供工具，以解释按照及中的方法进行的产品放行及稳定性测试所需要的微生物限度时，其测试的频率为何可以减少和如何筛选需测试的控制菌。水分活性水分活性与微生物限度测试USP强调了应当按照GMP法规要求，根据风险评估，排除产品中的其他微生物的存在。水分活性为什

19、么要减少微生物限度测试？1.许多非无菌药品的微生物污染可能性很低，因此测试的价值不大2.微生物测试延长了产品放行周期，增加了库存成本和市场缺货的机会水分活性机会1.通过处方、生产工艺、病患数据、测试历史的评价证明，液体/粉末胶囊、片剂、直肠栓剂、局部用膏剂、吸入剂及唇膏可以从每批测试变为周期测试2.随着处方中水分活性的降低，其他剂型对微生物的抵制力也会增加3.在设计水性口服或局部剂型时，应当评估候选处方的水分活性，使药品尽量具有自我防腐的作用。如，氯化钠、蔗糖、乙醇、丙二醇或甘油浓度的小小变化会降低药品中水分活性，从而阻碍产品中微生物的增殖4.对于可能被使用者污染的多剂量产品尤其有价值5.对包

20、装进行研究，以测试产品稳定性，并确定容器密封系统能够防止贮存过程中水分侵入造成的水分活性增加，从而保护产品水分活性测试策略水分活性高于0.75的多剂量水性药品需要加入防腐剂并将微生物测试作为常规放行测试水活性低于0.75的药品不需要额外防腐，在风险评估后不需要将微生物限度测试作为常规放行测试水分活性 水分活性（Aw）微生物0.97铜绿假单胞菌0.95大肠、沙门、产气荚膜梭菌0.90枯草芽孢杆菌0.86金黄色葡萄球菌0.75盐生盐杆菌0.90啤酒酵母0.77黑曲霉0.62嗜高渗压酵母0.61耐旱真菌 无菌工艺无菌产品 对病患有着最高的风险 无菌产品必须在最严格的标准控制下生产 “灌装制剂或包装器

21、械通过最终灭菌以保证产品微生物污染的风险控制在最低，是一个共识。然而，有些产品是通过一系列的无菌步骤进行生产，而不是最终灭菌。”无菌工艺 无菌工艺用于防止活的微生物在生产过程中的任何步骤中污染产品，对于这些生产步骤而言，没有任何的后续步骤可去除这些微生物。无菌工艺生产的产品的组成成分可能已经经过灭菌工艺处理。如，液体已经过滤除菌。无菌工艺 我们如何得到一个无菌环境呢？微生物污染从哪里来？最高风险 低风险 人员 原材料 设备 环境无菌工艺无菌工艺微生物的含义：非分类学上名词，是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细 胞、甚至无细胞结构的低等生物的通称种类：微生物类群十分庞杂，包括：无细胞结构的病毒

22、、类病毒、拟病毒等属于原核生物的细菌、放线菌等属于真核生物的酵母菌和霉菌，单细胞藻类等。微生物学快速课程特点：个体小 结构简单 繁殖快 易培养 易变异 分布广无菌工艺 无菌工艺 目前已知的微生物种数为15 20万种 你能看见的 无菌工艺 你不能看见的 无菌工艺 质量源于设计（QbD）对无菌工艺，设计目的是“人员介入最小化”无菌工艺 质量源于设计（QbD）设计考虑：a.多级屏障系统b.设施设备光滑，材料能耐受频繁的清洗、消毒c.足够大的更衣室d.准备室与灌装区的有效分隔e.适当的气锁及风淋设施f.风压、单向流、换气次数控制g.湿度、温度控制h.书面的消毒方案计划i.人员培训，等关键的检测要求包括

23、：1.定期环境过滤器检查2.常规粒子及微生物环境监测3.可以包括定期无菌培养基灌封 无菌工艺 无菌工艺洁净室和其他受控环境的微生物评估“该通则讨论了和原料药、成品、及某些情况下的医疗器械的无菌工艺的相关内容，以及受控环境的微生物质量的建立、保持和控制。”“微生物评估”指监测微生物的数量及种类生产场地内的很多区域需要做这样的监测 无菌工艺洁净室和其他受控环境的微生物评估“该通则讨论了和原料药、成品、及某些情况下的医疗器械的无菌工艺的相关内容，以及受控环境的微生物质量的建立、保持和控制。”“微生物评估”指监测微生物的数量及种类生产场地内的很多区域需要做这样的监测 无菌工艺洁净室和其他受控环境的微生

24、物评估为什么关心微生物的数量及种类监测？没有小心的微生物控制，无菌工艺就没有作用 无菌工艺洁净室和其他受控环境的微生物评估通则包括：粒子计数基础上的洁净室分类受控环境的微生物评估计划人员培训微生物评估计划的设计与实施只能过的关键因素 无菌工艺制定取样计划建立微生物警报限与行动限微生物取样方法与设备培养基和稀释液微生物鉴别通过培养基灌装进行操作评估术语表 无菌工艺洁净室和其他受控环境的微生物评估注意事项：很多方法可用于受控无菌生产环境的微生物评估该通则中的数值仅供参考 无菌工艺洁净室和其他受控环境的微生物评估注意事项：即使符合了该通则中建议的数字限度，也不保证有适当的微生物控制同样的，即使不符合

25、该通则中建议的数字限度，也不说明没有适当的微生物控制 无菌工艺洁净室和其他受控环境的微生物评估注意事项：如果你取样及/或微生物分析不正确，很有可能你会导致污染该通则中的取样培养基、器械及方法不是法定测试方法，仅供参考 无菌工艺洁净室和其他受控环境的微生物评估注意事项：标示无菌的大部分产品是无菌工艺生产的，而不是最终灭菌生产的原材料及环境中的微生物水平，在很大程度上影响产品的微生物质量 无菌工艺洁净室分类的建立ISO 14644讨论了洁净室和受控环境的设计与建设按ISO 14644的分类是建立在环境中每单位体积的总体粒子数的基础上分类不区分非生物粒子或生物粒子 无菌工艺洁净室分类的建立警告：非生

26、物粒子数量和活的微生物浓度之间的关系在科学上未达成绝对的一致当操作人员是粒子的来源时，以下的结论是成立的，即洁净室中的粒子越少，空气中微生物存在的可能性就越小。无菌工艺洁净室分类的建立警告：设备运行时大量产生的粒子污染和人员产生的粒子污染之间是无法明确区分的既然我们在讨论微生物评估的内容，而ISO 14644的分类又不与微生物绝对相关，那为什么还要关心分类的问题呢？无菌工艺洁净室分类的建立大量的药物除了微生物以外还有粒子限度的要求几乎肯定的是，部分悬浮粒子与微生物有关因此，洁净室监测计划包括微生物与粒子数两方面是正常的及恰当的 无菌工艺环境计划是和生产设施及环境相匹配的大部分情况下：大豆酪蛋白

27、水解琼脂要考虑到霉菌/酵母菌检测通常厌氧菌不必常规检测，但如果无菌环境中发现此类微生物，需增加取样频率 无菌工艺微生物的警报限与行动限微生物环境监控的警报限是指某一个微生物水平，其显示出正常的操作环境可能产生了漂移超过警报限不是必须要有明确的纠正措施，然而至少提醒应有书面的跟踪调查，可能包括取样计划的修改 无菌工艺根据类似厂房及工艺经验；及对至少几周的微生物环境水平的数据进行评估，以得到基准微生物的警报限与行动限如果没有历史数据用于建立限度怎么办呢？无菌工艺微生物的警报限与行动限从污染微生物数量，种类进行分析，了解环境情况潜在的变化，及时分析原因，采取行动，使环境保持在要求的条件下。如微生物数

28、量远低于警报限，考虑限度是否合理如微生物数量上升趋势考虑操作，清洁流程是否合理如微生物数量波动剧烈，考虑多次操作之间是否一致如重复出现同样或同类微生物 需评估消毒剂有效性 评估清洁操作流程合理性 无菌工艺一些能够降低人与产品接触的系统屏障在无菌工艺系统的前后，用于限制人员与被屏障保护的无菌区域的接触吹瓶/灌装/封口吹瓶，灌装，封口在一套设备上完成隔离器该技术有双重目的。一是保护产品不受污染；二是保护人员不受伤害 无菌工艺结论环境监控是一种重要的方式，以保证洁净室或无菌生产区域受到适当水平的控制监测室定性的活动，即使应用于无菌生产这种最关键的活动中，批产品接受与否的结论也不应该仅仅依赖于环境取样

29、的结果 无菌工艺结论本质上没有人员操作的环境通常在起始阶段即仅有非常低的污染率，并在使用中维持非常低的微生物污染率然而，人类介入的洁净室情况完全不同。研究显示，即使人员非常小心并正确着装，操作员还是会不断地将微生物带入环境因此，期望始终看到环境结果为0，即使在关键区域或关键表面上，也是不合理的 无菌工艺结论洁净室操作人员，尤其是参与无菌生产的人员必须努力维持适当的环境质量，并不断改进人员操作和环境控制无菌生产机检测中介入人员的减少及去除，将减少微生物污染的风险，从而提高产品安全目标始终是把污染的发生率降至最低水平 无菌工艺结论在无菌生产中保证产品安全的唯一方式是通过彻底的培训，遵守严格的纪律，监督和限制人员对关键区域的接触，将风险降到最低我们必须通过系统性地去除污染风险来建立生产的质量谢谢！