T噬菌体的RNA聚合酶课件.ppt
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- 噬菌体 RNA 聚合 课件
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1、 第9章转录9.1 引言9.2 转录发生在没有配对的DNA转录泡中,并根据碱基互补配对原则进行9.3 转录的三个阶段9.4 T7噬菌体的RNA聚合酶-一个良好的模型系统9.5 晶体结构提示酶的移动模型9.6 细菌RNA聚合酶由多个亚基组成9.7 RNA聚合酶包括核心酶和因子9.8 在起始点与因子的结合会发生变化9.9 被停止的RNA聚合酶可以再次启动9.10 RNA聚合酶是如何找到启动子序列的9.11 因子控制与DNA的结合9.12 启动子的识别依赖于一些共有序列9.13 突变可增强或降低启动子效率9.14 RNA聚合酶结合到DNA的一面上9.15 超螺旋是转录的一个重要特征9.16 因子的替
2、换可以控制启动9.17 因子和DNA直接接触9.18 因子可以组成级联反应9.19 芽孢形成由因子控制9.20 细菌RNA聚合酶的终止发生在不连续的位点9.21 大肠杆菌的两种终止子9.22 因子如何工作?9.23 抗终止是一个调控的过程9.24 抗终止需要和终止子无关的特殊序列9.25 终止子、抗终止子因子与RNA聚合酶的相互作用9.26 小结9.1 9.1 引言引言转录物RNA与双链DNA的一条单链在序列上完全一致,这条DNA单链称为编码链。另一条DNA单链是转录RNA合成的模版,也成为模板链,它与编码连互补。RNA的合成是由RNA聚合酶催化的。当RNA聚合酶结合到基因起始处,即称为启动子
3、的特殊序列上时,转录开始进行。最先转录成RNA的一个碱基对时转录起始点,启动子序列围绕在它周围。从起始点开始,RNA聚合酶沿着模版链不断合成RNA,直到遇见终止子序列。一个转录单位就是从启动子到终止子的一段序列,或者说是一段以一条单链RNA分子为表达产物的DNA片段,这是转录单位的重要特征。一个转录单位可以包括一条以上基因。位于转录起始点前面的序列称为上游序列,起始点之后的序列(在转录序列中)称为下游序列。序列的书写方向为从上游(左)到下游(右),信使RNA为5-3的方向;通常只写出和RNA完全相同的DNA编码链的序列。转录起始点的碱基编号为+1,其它碱基的编号按照从上游到下游递增的规律给出。
4、在起始点前面的碱基编码为-1,并且越往上游负值越大,没有编号为0的碱基。转录的直接产物叫做初始转录物,包含由启动子到终止子转录而来的RNA。关键概念:RNA聚合酶将两条DNA链暂时分开,形成“转录泡”,接着使用其中的一条链作为模板,指导合成互补的RNA。“转录泡”的长度是12-14bp,其中RNA-DNA杂合链的长度是8-9bp。9.2 9.2 转录发生在没有配对的转录发生在没有配对的DNADNA转录泡中,并根据碱基互补配对的原则进行转录泡中,并根据碱基互补配对的原则进行RNA合成发生在“转录泡”处,根据碱基互补配对的原则。在转录泡处,DNA双链被打开,成为两条短暂的单链,其中的模板链指导RN
5、A链的合成。RNA链从53的方向合成。37下总反应速度是40个核苷酸左右。翻译速率(15个氨基酸),DNA复制速率800bp。当RNA聚合酶结合到启动子上时,转录泡形成。当RNA聚合酶沿着DNA移动时,转录泡也随之移动,同时RNA链逐渐增长。转录泡中碱基配对和逐个递加是由酶催化完成的。含有RNA聚合酶的转录泡的放大结构随着RNA聚合酶沿着DNA模版链的移动,它在转录泡的前端(解链点)解开双链体,并且在转录泡的后端(再螺旋点)重新聚合,形成DNA双链。转录泡的长度为12-14个碱基对,但其中的DNA-RNA杂合链的长度较短。关键概念:RAN聚合酶结合DNA启动子序列后,转录启动。在延伸过程中,转
6、录泡沿DNA移动,RNA链从5向3方向增长在终止子转录终止,DNA双链重新聚合,RNA聚合酶从DNA链上解离下来。9.3 9.3 转录的三个阶段转录的三个阶段转录发生在几个阶段:模版识别:RNA聚合酶和双链DNA在启动子处结合,并形成转录泡;闭合复合物解链开放复合物起始:RNA链的第一个核苷酸键的合成。在合成前9个核苷酸键时,RNA聚合酶停留在启动子处。只有当聚合酶成功的在链上延伸并离开启动子后,启动期才结束。延伸:聚合酶沿DNA移动,不断合成RNA链。酶的移动使DNA双链不断解旋,不断暴露出新区段单链。核苷酸共价结合到延伸RNA链的3端。在松弛区域形成DNA-RNA杂合链。终止:识别不能再加
7、入任何碱基到延长链上的位点。最后一个碱基加到RNA链上时,转录泡裂解,RNA-DNA杂合链破坏,DNA重新合成双链螺旋,酶和RNA全部释放。终止子是转录终止所需要的DNA序列。关键概念:T3和T7噬菌体的RNA聚合酶由一条肽链构成,具有最低限度的聚合酶活性,仅能识别少数噬菌体的启动子序列。T7噬菌体的RNA聚合酶和DNA的结晶结构确定了DNA结合域和酶的活性位点。9.4 T79.4 T7噬菌体的噬菌体的RNARNA聚合酶聚合酶-一个良好的模型系统一个良好的模型系统T7噬菌体RNA聚合酶结合到转录起始点上游的一个位置,依靠插入DNA的大沟来识别靶序列。所有RNA聚合酶的共同特征是酶所识别的特定D
8、NA序列都位于被转录序列的上游。9.5 9.5 晶体结构揭示酶的移动模型晶体结构揭示酶的移动模型细菌真菌RNA聚合酶的表面都有一个宽约25的槽或沟。可能是DNA经过的位置。细菌可容纳16个碱基对,真菌可容纳25个碱基对。酵母RNA聚合酶有12个亚基,晶体结构定位了酵母RNA聚合酶的10个亚基。催化位点位于两个大亚基(1,2)之间的沟缝中。当DNA进入RNA聚合酶是,下游的钳子结构可以夹住DNA链。亚基4,7没有出现在晶体结构中,它们形成的亚复合物可以从全酶中脱离下来。DNA被蛋白质包围了约2/3由于相邻蛋白质分子的阻隔,DNA被迫在火星位点的入口处改向并通过一个孔道进入。RNA聚合酶活性区域的
9、放大图显示,转弯处模板链上的碱基外翻,直接针对这核苷酸入口。RNA-DNA的杂合链由9bp长,在5端,当RNA遇到舵型蛋白时,它被迫从DNA上解离下来。在碱基加入之后,聚合酶相对于核苷酸移动之前,这些特殊位置上的接触必须被打断,才能使酶移动,而后可以和出现在特殊位置上的新碱基重新形成接触。聚合酶必须在特定位置与碱基形成一系列特殊的接触。蛋白质中,一个称作桥梁的结构和活性位点是相邻的(图9.12)。桥梁结构的构象改变和酶在核苷酸链上的转位是密切相关的。聚合酶转位循环开始时,桥梁结构紧邻着核苷酸入口,构象直挺,这使得下一个核苷酸可以在入口处结合。桥梁结构和新添加的碱基紧密接触,然后聚合酶在DNA链
10、上移动一个碱基距离。桥梁构象改变,弯折以保持和新加入的核苷酸链接触。在这个构象中,桥梁结构遮掩了核苷酸入口。循环结束时,桥梁结构重新回到它的直挺构象,并打开核苷酸入口。以便于下一个核苷酸进入。关键概念:细菌RNA聚合酶的核心酶是500kDa大小的多亚基复合物,一般结构为2结构。DNA夹在一个通道中,和以及亚基接触。9.6 9.6 细菌细菌RNARNA聚合酶由多个亚基组成聚合酶由多个亚基组成在细菌中,一种RNA聚合酶几乎负责所有mRNA、rRNA和tRNA的合成。大肠杆菌 7000 RNA聚合酶,2000-5000参与合成,亚基一起构成催化中心。亚基可与模版DNA、RNA产物和核苷酸底物相互交联
11、。亚基是装配核心酶所必需的亚基识别启动子交联实验鉴定出了RNA聚合酶的亚基与DNA接触的位点。稳定已经分开的单链DNA利福平可以抑制细菌RNA聚合酶的转录,是对付肺结核的主要药物。利福平分子结合到亚基的一个口袋中,这个位点尽管与活性位点的距离大于12,但它阻止了RNA的延伸。因此利福平通过阻止RNA链延伸超过2-3个碱基从而阻止了转录发生。具有催化RNA合成能力的最好复合物可以被描述为RNA聚合酶。它负责底物核苷酸与DNA的配对,并催化核苷酸链之间形成磷酸二酯键。关键概念:细菌RNA聚合酶可以分成具有催化转录活性的2核心酶以及仅在转录时所需的亚基。因子改变了RNA聚合酶结合DNA的性质,使得它
12、对一般的DNA的亲和力下降,而对启动子的亲和力增加。根据每个启动子上的转录起始频率计算,RNAJU和美对不同启动子的亲和常数,可有6个数量级上的差别。9.7 RNA9.7 RNA聚合酶包括核心酶和聚合酶包括核心酶和因子因子全酶(2)可分2部分:核心酶(2)和因子(多肽)。只有全酶才能起始转录。因子仅能保证细菌RNA聚合酶稳定结合到启动子上,它通常在RNA合成8-9个碱基后释放,离开负责延伸的核心酶。核心酶不能区别启动子和其他DNA序列,依靠碱性蛋白和酸性核苷酸间的静电引力结合。因子可以是RNA聚合酶与DNA的亲和力发生很大变化因子也具有识别特异结合位点的能力关键概念:当RNA聚合酶结合到启动子
13、上时,它将两条DNA链分开,形成转录泡并使9个核苷酸转录为RNA。酶进入下一阶段之前,需要跳过失败的起始循环。当新生RNA链达到8-9个碱基时,因子从RNA聚合酶上解离下来。9.8 9.8 在起始点与在起始点与因子的结合会发生变化因子的结合会发生变化全酶和启动子通过形成闭合二元复合物开始反应。闭合即DNA保持双螺旋。与酶结合的一小段DNA序列的溶解导致了闭合复合物转变为开放复合物。称为紧密结合。对于强启动子来说,这个反应是不可逆的。因子参与溶解反应两个初始核苷酸之间的连接,形成磷酸二脂键,产生三聚体,包括RNA、DNA、聚合酶。失败释放短(2-9)核苷酸链。起始过程完成后,聚合酶释放出因子而转
14、变为核心酶,后者和DNA、新生RNA组成延伸三聚体。转录过程中复合体发生了形态变化,根据形态和大小的转变,复合体可分为3类:RNA聚合酶最初结合到DNA,覆盖-55到+20约75-80bp区域。RNA聚合酶长度可覆盖50bpDNA弯曲。起始到延伸,聚合酶不再与-55到-35区域结合。当RNA链延伸到15-20bp碱基是,酶会发生进一步形态变化,转变成负责转录延伸的复合体,覆盖30-40bp长度。关键概念:所有被终止的RNA聚合酶都可以通过剪切RNA转录物产生新的3端来重新开始转录。9.9 9.9 被停止的被停止的RNARNA聚合酶可以再次启动聚合酶可以再次启动RNA聚合酶必须能够处理转录被阻断
15、时的突发情况。聚合酶可以通过切割RNA的3端,产生延伸链的新的3端使得转录延续。RNA聚合酶的催化位点在各种情况下都能执行切割功能。RNA聚合酶在DNA上退行,RNA的3端以单链形式暴露,进行切割,切割事件使正常延伸复合体重新装配。可能的原因:转录停滞造成模版位置错乱,3端不在位于活性位点,切割和倒退把末端放入正确位点所必需。关键概念:RNA聚合酶结合到启动子上的速率极快,所以不可能是靠随机扩散结合的RNA聚合酶可能随机地结合到DNA的某个位点上,然后快速地滑动并替换结合的DNA,直到发现启动子序列。9.10 RNA9.10 RNA聚合酶是如何找到启动子序列的聚合酶是如何找到启动子序列的酶存在
16、状态:多余的核心酶像闭合松弛复合物那样大,因为因子加入快,解离慢,所以游离核心酶很少。因子在细胞中的含量很多,可提供细胞内1/3的RNA聚合酶组装成全酶。约有一半的核心酶从事转录游离的全酶,推测含量较少启动子识别结合位点的最简单模型:RNA聚合酶以随机扩散的方式移动,全酶很快与疏松结合位点结合或解离,不断形成和破坏一系列的闭合复合物,直到遇到(随机)启动子,然后他识别这段特殊序列,形成开放复合物而牢固结合上去。由扩散理论,RNA聚合酶从一个结合位点扩散到第二个结合位点的速率是非常慢的。所以可能存在其他的聚合酶结合启动的的机制。如果RNA聚合酶的起始靶位不仅是一段特殊的序列(启动子),而是整个基
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