Brucellosis布氏杆菌病课件.pptx

1、Brucellosis in Humans and Animals人兽布鲁氏菌病杨 伟学到点什么？布氏杆菌 病原和流行病学 危害 血清学 疫苗简介简介 布鲁氏菌病是公认的人兽共患病人兽共患病，既影响人的身体健康，又影响畜牧业发展，并可危及食品安全，造成严重的社会和经济损失，已成为全球特别是发展中国家所面临的重要公共卫生问题之一。2000 年以来中国布鲁氏菌病疫情持续上升，2014 年全国共报告病例 57222 例，报告发病率 4.22/10 万，在法定传染病排名中从 2000 年的第 16 位上升至 2014 年的第 6 位。目前中国的布鲁氏菌病疫情处于历史上最严重时期，疫情分布在全国全国 3

2、1 个省个省（区、直辖市）和新疆生产建设兵团，内蒙古、吉林和黑龙江等北方省（区）出现暴发和流行暴发和流行。布鲁氏菌病的全球发病率http:/dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(06)70382-6病原布鲁氏布鲁氏杆菌（杆菌（Brucella）革兰氏阴性小杆菌（0.5-0.7m x 0.6-1.5m）初次分离时为球杆状和卵圆形 传代培养后渐成短小杆状 无鞭毛，不运动 不形成芽孢和荚膜（S型菌有荚膜）病原扫描电镜中的布鲁氏杆菌Charles Van der Henst,Marie de Barsy,Angeles Zorreguieta,Jean-Jacques Letes

3、son,Xavier De Bolle The Brucella pathogens are polarized bacteriaMicrobes and Infection,Volume 15,Issues 1415,2013,9981004http:/dx.doi.org/10.1016/j.micinf.2013.10.008布鲁氏杆菌属 6个种，个种，20个生物型个生物型 1、马耳他布鲁菌（Br.melitensis）：1、2、3型 2、流产布鲁菌（Br.abortus）:1、2、3、4、5、6、7、8、9型 3、猪布鲁菌（Br.suis）:1、2、3、4、5型 4、沙林鼠布鲁菌（Br

4、.neotomae）:5、绵羊布鲁菌（Br.ovis）:6、犬布鲁菌（Br.canis）：布鲁氏杆菌属宿主牛种羊种猪种犬种绵羊附睾种牛+（罕见）-水牛+-北美野牛+-绵羊+（罕见）+（可能）-+山羊+（罕见）+-猪+（罕见）+（罕见）+-狗+（罕见）+-骆驼+（罕见）+-北美驯鹿/驯鹿-+（4 型）-麋鹿+-马+（罕见）+（罕见）-啮齿类动物+（罕见）+（罕见）+（5 型）-布鲁氏菌属感染的动物临床症状 人布鲁氏菌人布鲁氏菌病病 人布鲁氏菌病通常表现为急性发热性疾病。羊种布鲁氏菌感染人群最多。所有年龄组均可感染。并发症可以影响任何器官系统。疾病可存在复发、慢性局部感染或延迟康复。骨和关节病变是

5、布鲁氏菌病最常见的并发症，40%以上病例可出现。睾丸炎和附睾炎是男性布鲁氏菌病最常见的泌尿生殖系统并发症，常发生在单侧。布鲁氏菌病妊娠期间有自然流产和宫内传播的风险，流产是动物布鲁氏菌病常见并发症。布鲁氏菌菌血症可导致人流产，尤其是在妊娠早期。临床症状 动物布鲁氏菌动物布鲁氏菌病病 布鲁氏菌可感染多种动物，尤其是牛、绵羊、山羊和猪。不同种型的布鲁氏菌优先感染的动物不同。动物布鲁氏菌病典型表现是流产。只有通过实验室检测方可确诊。大约在怀孕第4 个月，布鲁氏菌病可以导致绵羊或山羊的流产。公牛感染羊种布鲁氏菌的附睾炎（附睾的末端）流行病学 人布鲁氏菌病人布鲁氏菌病流行病学流行病学 牛、绵羊、山羊和猪

6、是布鲁氏菌主要的宿主。通过职业或环境接触感染动物及其制品而传播给人。食物传播是主要感染来源，用生奶和未消毒的奶制作奶酪是高风险。布鲁氏菌病是旅行相关性旅行相关性疾病。血液或移植的器官/组织是可能的传染源。人际传播极其罕见。流行病学 动物布鲁氏菌病动物布鲁氏菌病流行病学流行病学 牛通常感染牛种菌，然而羊种菌和少数的猪种菌也能感染牛。羊种菌主要感染绵羊和山羊，猪种菌感染猪。随着直接接触和流产后污染环境而出现传播。性传播和（或）人工授精传播也很重要。可出现血清学反应阴性的潜伏感染。血清学检测 虎红平板凝集试验（RBT）酶联免疫吸附实验（ELISA）试管凝集试验（SAT）补体结合实验（CFT）虎红平板

7、凝集试验(RBT)血清样本筛查可以使用虎红凝集试验或卡片试验，即在白色瓷砖或搪瓷板上划出大约直径2cm区域，将血清25-30L（0.03mL）与等量的抗原混合，室温下轻轻搅拌混合物 4min 后观察凝集。任何可见的反应都认为是阳性的。任何可见的反应都认为是阳性的。该检测很敏感，因此，阳性样本应由CFT试验或 ELISA等IgG特异检测进行复核。尤其在急性感染的早期会出现假阴性反应。虎红凝集试验可用于所有动物，此外阳性结果应被定量试验确证。免疫动物可出现假阳性结果。虎红平板凝集试验判定标准-：阴性：阴性无凝集，呈均匀粉红色+：弱阳性弱阳性稍能查到凝集，稍有卷边形成，凝集物间液体呈红色+：强阳性：

8、强阳性 凝集块程菌丛状，凝块间液体明显清亮+：弱阳性：弱阳性 形成较明显卷边，凝集块间液体稍清亮酶联免疫吸附试验（ELISA）目前有很多改良的间接 ELISA 可用于商业检测。只有使用光滑型牛种或羊种布鲁氏菌脂多糖的 ELISA 是被推荐的。检测操作用 96 孔平底聚苯乙烯聚苯乙烯微平板。由于是观察背景结果，故微平板的选择对检测性能有轻微影响。中低蛋白结合微孔板对使用 LPS 抗原也有影响。酶联免疫吸附试验（ELISA）间接酶联免疫吸附试验备选筛查（或确证）试验 优点：优点：1、酶联免疫吸附试验灵敏度和特异度很好，稳定性强，操作简单，设备需求少并且有市售试剂盒。2、酶联免疫吸附试验比虎红平板试

9、验或补体结合试验在特异性上稍高一点。缺点：缺点：酶联免疫吸附试验比虎红平板试验更敏感，但有时检测不出虎红平板试验检测阳性的样本。试管凝集试验（SAT）本试验在容量12ml清洁的玻璃或塑料试管中进行，将0.8ml 石碳酸盐水（0.5%石 碳酸加入 0.15M 的盐水）加入到第1管，其余 5 10 个管加入 0.5ml，再向第 1 管加入0.2ml 血清，混匀后，将0.5ml 混合液移至第 2 管，接着将 0.5ml 移至第 2 管后面的管，进行一系列倍比稀释，用酚盐溶液将同等体积的标准牛种凝集悬液稀释到工作浓度，添加到除第1个管外的每个管，然后将试管放置 37温箱 20h。试管凝集试验判定标准

10、参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读+菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮;+菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮;+菌体凝集显著，液体50%清亮;+凝集物有沉淀，液体25%清亮;-凝集物无沉淀，液体均匀混浊。优点：试管凝集试验广泛应用于布鲁氏菌病的诊断，操作简单、成本低廉 缺点：但缺乏灵敏度和特异度，意味着只在无替代方法的时候才使用。补体结合实验（CFT）1、使用96 孔U 底微滴定平板，第一、二排孔中放稀释的检测血清25l，除第一排外的所有孔中放CFT 缓冲液25l。、将25l 血清从第二排向前连续倍比稀释。、将稀释到工作浓度的抗原25l 和1.25 单位浓度的补体25l 添

11、加到每个孔中，控制孔中只包含稀释液，血清+补体+稀释液，抗原+补体+稀释液，补体+稀释液，使每个样本共包含75l 液体。、将平板搅拌10min 后37放置30min，或4过夜。、将致敏红细胞（致敏红细胞（SRBC）悬浮液25l 添加到每个孔中，搅拌平板10min 后37放置30min。、再将平板4放置2 3h,让未溶的细胞沉淀后读取结果。补体结合实验（CFT）补体结合试验可能是诊断动物布鲁氏菌病应用最广泛的血清学试验溶血程度是与标准0%,25%，50%,75%和100%细胞溶解比较其一致程度。结果要用国际单位表示，即计算得出与国际标准血清平行的滴度。通常，血清固定滴度20 ICFTU/ml，被

12、认为是阳性。在分析人血清试验结果时，应考虑病史。优点：补体结合试验具有良好的敏感性和特异性。缺点：方法复杂，操作需要良好的实验室设施和训练有素的人员。如果具备这些条件，在保证质量的前提下定期实施该检测，结果会较为理想。补充试验 其他血清学检测方法也被使用，虽然更特异，但存在许多缺点。目前，标准实验室都不建议使用这些方法：乳汁检测：有效且常用于检测产奶动物 乳环试验（MRT）：简单有效，只能用于牛奶 乳汁酶联免疫吸附试验：检测散装奶 荧光偏振法：需要特殊试剂和读取设备 皮内实验：在免疫动物中会出现假阳性治疗 人布鲁氏菌病人布鲁氏菌病治疗治疗 人布鲁氏菌病治疗的基本要素是保证抗生素的有效性和足够的

13、疗程。无并发症成年人病例和8岁及以上儿童病例治疗：多西环素每天2次，每次100mg，持续6周+链霉素每天1g，持续23周。或：多西环素每次100mg，每天2次，持续6周+利福平每天600900mg，持续6周。人布鲁氏菌病的预防 人布鲁氏菌病预防人布鲁氏菌病预防要点要点 人布鲁氏菌病预防基于职业卫生和食品卫生。通常不推荐人接种疫苗。所有奶制品的制备都应食用加热处理后的奶。避免食用生奶或生奶制品。人布鲁氏菌病的预防 肉需要充分煮熟。实验室工作者应采取特殊预防措施。医生和卫生工作者应意识到感染布鲁氏菌病的可能性。公众健康教育应强调职业卫生和食品卫生。布鲁氏杆菌病疫苗 疫苗疫苗 牛种布氏杆菌19(B.

14、abortus strain 19,S19)疫苗 羊种布氏杆菌Rev.1(B.melitensis Rev.1,Rev.1)疫苗 猪种布氏杆菌S2(B.suis strain 2,S2)疫苗 牛种布氏杆菌45/20(B.abortus strain 45/20,45/20)死菌佐剂苗 粗糙型牛种布氏杆菌株51(Rough strain B.abortus51,RB51)疫苗牛种布氏杆菌S19活疫苗 制苗菌种为牛种布鲁氏菌弱毒株弱毒株A19，1923年从牛奶中分离并在实验室培养过程中制弱。菌株中含有O 链的脂多糖(LPS)能持续刺激机体产生抗体,对牛有一定的保护力,历史上曾将S19 株广泛应用于

15、牛的免疫接种。缺点：缺点：1、该菌株能传染人,并会引起怀孕母畜的流产。2、无法区分是自然感染还是人工免疫。羊种布氏杆菌Rev.1活疫苗 Rev.1 是一种毒力减弱株,属于光滑型。对猪、牛、羊布氏杆菌均具有免疫保护力。可以通过口服或肌注的方式进行免疫。缺点：缺点：1、Rev.1 作为疫苗仍具有一定的毒力，在适当的条件下,毒力可以完全恢复。2、Rev.1 对链霉素具有抗性。3、Rev.1 引起的流产率比S19（S19低于1%）略高。4、Rev.1免疫动物后会干扰临床诊断。猪种布氏杆菌S2 该疫苗是用中国分离株制造的,其毒力比S19 和Rev.1弱,对猪、牛和羊均能产生良好的免疫。由于其毒力较弱,接

16、种后不会导致母畜的流产。缺点：缺点：S2疫苗株对人体有一定毒性，对养殖人员和兽医构成威胁。S2的保护率较S19和Rev.1低约10%-20%。牛种布氏杆菌45/20疫苗 该疫苗制造用菌株是1922 年从病牛体中分离,后经豚鼠20 次传代后获得粗糙型的减毒株。优点是LPS 结构中无O 链,因此免疫动物以后,在其体内检测不到O 链的抗体,从而可以避免干扰诊断。缺点：缺点：1、该菌株作为疫苗的免疫机制仍不清楚。2、粗糙型的45/20 疫苗株最严重的问题是该菌株极不稳定,经常会出现从R 型到S 型的变异,使其毒力恢复为强毒,因此其作为疫苗的安全性仍有争议。粗糙型牛种布氏杆菌株51（RB51）该疫苗株最

17、初由光滑型牛布氏杆菌2308 株经体外反复传代,并经利福平和青霉素的筛选获得。具有利福平抗性的RB51 是当前应用应用最为广泛最为广泛的疫苗。多年的实践证明其免疫力和保护力均优于S19,并克服了以往疫苗的一些弱点。缺点缺点：菌苗注射法不能用于 孕畜和小尾寒羊的免疫。疫苗的研究现状 目前对布氏杆菌的疫苗研究主要是利用基因工程技术,对布氏杆菌的部分基因进行各种修饰,以期在现有疫苗的基础上筛选出具有更强免疫保护力、且毒力稳定的弱毒株。另外人们也试图研究布氏杆菌的DNA 疫苗。重组粗糙型布氏杆菌疫苗 为了使S型菌从根本上变成R 型菌,科学家们目前主要是利用分子生物学的方法,破坏或缺失S-LPS 合成酶

18、基因。现已发现与S-LPS合成相关的基因包括:gmd、per、wbkA、wbkC、lpx、wa、wz等,相关的重组菌已构建成功,其毒力和免疫保护试验结果还需大量的动物试验证实。布氏杆菌DNA 疫苗 DNA疫苗疫苗是指直接将带有目的抗原基因的重组质粒转染或注射到动物细胞中,使之在细胞内持续表达天然的抗原物质。DNA免疫动物后,可以长期表达目的蛋白,然后以肽的形式递呈给MHC类分子,再激活抗原特异性T细胞,诱发特定的免疫反应。引起的细胞免疫的几个分子：P39、Omp31、L7/L12、GroEL布氏杆菌重组亚单位疫苗 重组亚单位苗一般以体液免疫为主,对于以细胞内感染为主的布氏杆菌,其能达到的保护效果还需要进一步的探讨。目前有少量的这方面的研究,但仍停留在实验室阶段。我们唯一不得不害怕的就是害怕本身，如果你采取很害怕的态度对待科学，你将永远不会进步！谢谢大家的聆听！