07生物素亲和素课件.ppt

1、北京博富瑞基因诊断技术有限公司概述概述生物素亲合素系统（Biotin-AvidinSystem，BAS）是70年代末发展起来的一种以生物素和亲合素的特异结合反应为原理的新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于分子生物学各领域之中。1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法与桥联亲合素生物素技术。1981年Hsu首次报告了改进的亲合素生物素过氧化酶复合物法（ABC法）。近年大量研究证实，生物素亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、核酸等。生物素亲合素已成为目前广泛用于

2、微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。一)生物素二)活化生物素与标记三)亲和素及链霉亲和素四)亲和素及链霉亲和素的标记五)生物素-亲和素系统六)生物素-亲和素系统的应用功能：功能：可与多种标记物如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、核酸等结合。这些生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响。如抗体分子经生物素化后，其结合抗原的活性不受影响。同样多种酶结生物素化，其催化力也保持不变或稍有降低。概念：概念：生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。与亲合素结合与抗体或酶结合分子式：分子式：C10H16O3N2S 分子量：分子量：24

3、4.31等电点：等电点：PH=3.5溶解特性：溶解特性：难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)两个环状结构：两个环状结构：I环（咪唑酮环）为与亲和素结合的主要部位；II环（噻吩环）为结合抗体和其它生物大分子的部位，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构结构特点：结构特点：咪唑酮环/四氢噻吩环 结合亲和素 侧链末端羧基结合蛋白质特性特性：羧基需经活化修饰活化修饰才能结合蛋白质（羧基活化的生物素称活化生物素或生物素衍生物）羧基羧基生物素的特点：1）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由于大分子蛋白质的空间位阻效应空间位阻效应，可影响生物素与亲和素间的结合；2）生物素只能依靠肽键肽键与蛋白质

4、上的氨基氨基结合。活化生物素活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻效应，又可扩大其结合的对象。生物素侧链的末生物素侧链的末端羧基经化学修端羧基经化学修饰后制成带各种饰后制成带各种活性基团的衍生活性基团的衍生物物活化生物素活化生物素(生物素化衍生生物素化衍生物物)活化生物素易活化生物素易与抗原、抗体与抗原、抗体酶及核酸分子酶及核酸分子中相应基团偶中相应基团偶联形成生物素联形成生物素化标记物化标记物 标记蛋白质标记蛋白质氨基氨基的活化生物素的活化生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）长臂活化生物素（BCNHS）标记蛋白质标记蛋白质醛基醛基的活化生物素的活化生物素 酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（B

5、CHZ）标记蛋白质标记蛋白质巯基巯基的活化生物素的活化生物素 3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）标记标记核酸核酸的活化生物素的活化生物素 光生物素、BNHS和BHZ生物素脱氧核苷三磷酸适合于Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA、蛋白的标记长臂活化生物素长臂活化生物素（BCNHSBCNHS）：）：生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离增加，更易发挥生物素的活性作用。如何减小空间位阻如何减小空间位阻生物素分子量小，当与抗体或酶形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合以及BAS的应用效果造成

6、干扰。如何减小空间位阻如何减小空间位阻标记特点：标记特点：BNHS和BCNGS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质生物素酰肼生物素酰肼(BHZ)(BHZ)：水合肼与生物素的合成物水合肼与生物素的合成物 主要用于标记主要用于标记偏酸性偏酸性糖蛋白糖蛋白 肼化生物胞素肼化生物胞素(BCHZ)(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接后，：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。再与无水肼反应而成。除醛基外，除醛基外，BCHZBCHZ还可标记氨基还可标记氨基标记特点标记特点：BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记马来

7、酰亚胺马来酰亚胺-丙酰丙酰-生物胞素（生物胞素（MPB)MPB)：能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素 光生物素(photobiotin)光敏物质 侧链上连接的芳香基叠氮物基团，经光照后，变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合，形成B-核酸探针，用于DNA或RNA的标记。目前常用光生物素和生物素化目前常用光生物素和生物素化dUTPdUTP作为标记核酸的活化生物素。作为标记核酸的活化生物素。N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHO生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法掺入到双链DN

8、A中。BNHS和BHZ 可直接标记核酸，但对碱基配对有影响（影响氢键的形成）特性：特性：活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性（是BAS多级放大作用的物质基础）；BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质,BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，活性降低；注意事项：注意事项：选择活化生物素：选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度0.55g/ml；生物素

9、13个/Ag，35个/Ab；使用交联臂减少空间阻力使用交联臂减少空间阻力概念：概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖蛋白，可由蛋清中提取。亲和素可以和4个生物素分子亲密结合，这虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。且由于多种生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响，故而二者在结合反应时具有的多级放大作用。主要包括：主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。结构：结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它是与生物素结合的基团。特性：特性：每个亚基都可结合

10、1个生物素分子，即1个亲和素分子可结合4个生物素分子。分子量：分子量：68 000亲和常数：亲和常数：1015/mol缺点：缺点：由于是碱性蛋白（PI=10），且含糖基，与聚苯乙烯的非特异性吸附较高，会导致本底增大，降低检测灵敏度。溶于水：溶于水：C=5mg/ml；比活性：比活性：A12u/mgP 概念：概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质。优点：优点：为弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，因此与聚苯乙稀的非特异性吸附远低于亲和素，因此应用广泛。结构：结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙氨酸含量较大。特性：特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分子。分子量：分子量：65000亲和常

11、数：亲和常数：1015/mol结构结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基PI PI 10.5 6结合位结合位 色氨酸 色氨酸生物素生物素 4 4KaKa 1015 1015活性活性 1315U 1518USASA表面所带正电荷少，且不含糖基，非表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合远低于特异性结合远低于AVAV，因此目前以，因此目前以SASA标标记的酶结合物更为常用。记的酶结合物更为常用。亲和素的标记：HRP(过氧化酶)的标记标记物：小分子物质：示踪物125I、胶体金、异硫氰酸荧光素(FITC)、化学发光物大分子物质：如酶、抗原、抗体、铁蛋白 改良过碘酸钠法戊二醛法链霉亲和素的标记方法：过

12、碘酸钠法HRP+NaIO4+SA 透析+KBH4 沉淀OOOOOONaIO4+NH2AvidinOOOHOHNAvidinH2OOOOHOOONAvidinNAvdinNaBH4Schiff碱酶-五炭糖环酶NH2亲和素NH2(CH2 2)3 3CHOCHO(CH2)3CHN酶CHN亲和素OOOOOONaIO4OOOHOH+NH2SAvidinNSAvidinH2OOOOHOOONSAvidinNAvdinKBH4Schiff碱酶-五炭糖环灵敏度高:生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原/抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，因

13、此，BAS具有多级放大作用，反应的灵敏度高。稳定性高和特异性强：AV/SA与生物素结合的亲和常数比抗原-抗体反应至少高1万倍，二者的结合呈高度专一性和不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以及反应试剂的高度稀释均不影响其结合。因此，BAS稳定性高，特异性强。适用性广泛：BAS的多级放大作用，以及既可 偶联生物大分子，又可连接标记材料，使BAS不 仅用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测 及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各 类反应体系中反应物的分离、纯化。其他：可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；反应试剂可高度稀释，特别是与一抗偶联使用可 大幅减少一抗用量，降低实验成本；实验

14、所需时 间不长。可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、间夹心法、间接法、竞争法接法、竞争法等，在此基础上引入A-B系统。BAB法：BA法：ABC法：BABBAB法（亲和素法（亲和素-标记生物素法）：标记生物素法）：特点：以游离亲和素为桥臂，分别连接生物素化抗原（或抗体）和标记生物素（如酶标生物素）Ag+BAb Ag-AbB A Ag-AbB-A BE Ag-AbB-A-BE+A+A亲和素亲和素-标记生物素法（标记生物素法（BAB法）法）：先使抗原与生物素（B）化的抗体结合，再以游离亲合素(A)将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。生物素化的抗体酶标生物素底物BABA法（

15、标记亲和素法（标记亲和素-生物素法）生物素法）特点：以标记亲和素/标记链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的游离亲和素（A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤。+A-E标记亲和素标记亲和素-生物素法（生物素法（BA法）：法）：以标记亲和素/标记链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的亲和素（A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤。A-E+A-E Ag+BAb Ag-AbB AE/SAE Ag-AbB-A/SAEABCABC系统（亲和素系统（亲和素-生物素生物素-过氧化物酶复合物系统）过氧化物酶复合物系统）特点:将BAB法中的A（亲和素）先与B-E（酶标生物素）结合，制备成复合

16、物ABC（亲和素-生物素-过氧化酶复合物），网络了大量酶分子，使该法的检测灵敏。度显著提高。ABC ABC法法 A+BA+BE A-BE A-BE-ABCE-ABC Ag+B Ag+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B ABCABC Ag-Ab Ag-AbB-ABC B-ABC（1 1）ABCABC复合物的制备复合物的制备：生物素生物素-PO过氧化物酶（PO）亲和素亲和素-生物素-POABC法中过氧化物酶常用辣根过氧化物酶，通过它与底物的显色程度来判断抗体或抗原含量并对其进行标记。此法广泛应用于免疫组织化学及酶联免疫吸附等技术中生物素化的二抗一抗过氧化物酶底物显色的反应混合物固定化抗原生（

17、2 2）ABCABC法反应原理法反应原理+Ab-Ag-Ab-B +ABC Ab-Ag-Ab-B-ABC 预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素（或链霉亲和素）-生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC（或SABC）复合物中未饱和的亲和素（或链霉亲和素）结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应体系与ABC（或SABC）标记体系连成一体进行检测+ABCABC法法 原理示意图原理示意图BABBAABCBAB与与ABC成员成员相同，反应顺序相同，反应顺序不同不同此外

18、，按待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物此外，按待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，素化第二抗体，BAS分为直接法和间接法。分为直接法和间接法。方 法 反应层次 直接法 BA Ag-(Ab-B)-A*BAB Ag-(Ab-B)-A-B*ABC Ag-(Ab-B)-A-B*C 间接法 BA Ag-Ab1-(Ab2-B)-A*BAB Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABC Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-B*CBAS实验方法及反应层次BAS在酶免疫技术中的应用BAS在荧光免疫技术中的应用BAS在放射免疫技术中的应用BAS在分子生物学中的应用BAS在在ELISA

19、中的应用：中的应用：生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定 BAB-ELISA夹心法测抗原的原理：夹心法测抗原的原理：用替代常规ELISA中的酶标抗体，与已与固相抗体结合的抗原抗体复合物结合，然后连接亲和素及酶标生物素，从而使反应信号放大，提高检测灵敏度BAS在在ELISA中的应用中的应用：BAS用于固相化抗原/抗体的制备：AV/SA先包被固相载体、抗原/抗体先与生物素结合 AV/SA-B反应而使抗原/抗体固相化。BAS用于ELISA的终反应放大：BA-ELISA、BAB-ELISA、ABC-ELISABAS在均相酶免疫测定中的应用：在均相酶免疫测定中的应用：BE*A-BE（酶因活性中心受空间位阻

20、作用而失活）反应系统：BE*、AgA、Ab（限量）、标准Ag/待检AgAgA和待检Ag竞争结合限量Ab，若Ag Ag Ab AgA AgA-BE酶活性变化与待测标本中抗原浓度呈负剂量相关。酶活性变化与待测标本中抗原浓度呈负剂量相关。（酶活性降低）（酶活性降低）ABAS用于荧光抗体技术通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体的夹心法 BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离

21、以生物素标记核酸探针进行的定位检测用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测 免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增扩增代替ELISA的酶催化底物显色。PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。1.抗原+生物素化抗体抗原-生物素化抗体复合物；2.加亲合素抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；3.加生物素化DNA抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；4.PCR扩增生物素化DNA部分。免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的还不多；实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。在报道的文献中均采用待检抗原直接吸附固相，这样固相的均质性必然对结果有很大的影响；同时检测的样品液中其它成分也可以吸咐固相，极易产生背景过高或精确度下降。如用微量板作为固相需选用配套的PCR仪，否则需将其移入反应管内，这必然导致很大的误差，经放大可产生显著差异。