(生化工程课件)两水相萃取.ppt

1、有机溶剂萃取的不足：有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。一、双水相萃取的优点一、双水相萃取的优点 使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分都占大比例（都占大比例（8595），这样生物活性蛋白质在两），这样生物活性蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于

2、两相中。相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。知识点：知识点：l两水相的形成 l相图 l分配理论 l影响分配的参数 l 两水相生物转化反应重点：重点：两水相的形成机理 影响因素 难点：难点：分配理分配理论论19 两水相萃取两水相萃取.v19.1 概述概述v特点特点v（1）保留生物分子活性）保留生物分子活性（2）除细胞碎片）除细胞碎片（3）表面张力低，耗）表面张力低，耗 能少能少（4）成本高）成本高（5）大分子及小分子萃取）大分子及小分子萃取双水相分离理论双水相分离理论1、双水相的形成双水相的形成 当两种聚合物互相混合时，究竟是否分层或混合成当两种聚合物互相混合时，究竟是否分层或混合成一相，取

3、决于两种因素：一为体系熵的增加，二为分子一相，取决于两种因素：一为体系熵的增加，二为分子间作用力。间作用力。熵的增加涉及到分子数量，与分子大小无关。当分熵的增加涉及到分子数量，与分子大小无关。当分子的物质的量相同时，大分子与小分子间的混合，熵的子的物质的量相同时，大分子与小分子间的混合，熵的增加是相同的。增加是相同的。分子间的作用力可看作分子中各基团间相互作用力之和。分子分子间的作用力可看作分子中各基团间相互作用力之和。分子量越大，分子间的作用力也越大。大分子间混合，分子间作用力决量越大，分子间的作用力也越大。大分子间混合，分子间作用力决定混合效果。混合分子间如存在空间排斥力，它们的线团结构无

4、法定混合效果。混合分子间如存在空间排斥力，它们的线团结构无法互相渗透，则在达到平衡后就有可能分成两相，形成双水相。互相渗透，则在达到平衡后就有可能分成两相，形成双水相。两水相体系形成两水相体系形成v两水相的形成两水相的形成分子之间作用力分子之间作用力v（1）A-A A-B 相分离相分离（2）A-AA-A 凝聚复合凝聚复合混溶性疏水梯度混溶性疏水梯度 两水相体系类型两水相体系类型v (1)高聚物-高聚物（PEG-Dextran）易于与后续处理连接(2)高聚物-盐(PEG-(NH4)2SO4)盐浓度高，蛋白质易盐析，废水处理困难相图杠杆定律19.3 双水相萃取过程的理论基础双水相萃取过程的理论基础

5、 表面自由能的影响表面自由能的影响表面电荷的影响表面电荷的影响表面积Donnan效应电荷3、物质在两相中的分配、物质在两相中的分配和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。表示。CT K=CB Ct、CB分别代表上相、下相中溶质的浓度分别代表上相、下相中溶质的浓度 K与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。1）表面自由能的影响）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对大分子物质表面性质对K影响很大影响很大)2）表面电荷的影响）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如

6、存在盐盐效应：两相系统中如存在盐,对对K影响较大影响较大)3）综合考虑）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验）（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验）4）影响分配平衡的参数）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响；聚合物的影响；(2)体系中无机盐离子的影响；体系中无机盐离子的影响；(3)体系体系PH的影响；的影响；(4)体系温度的影响；体系温度的影响；(5)体系中微生物的影响。体系中微生物的影响。19.4 影响分配的因素影响分配的因素(1)聚合物组成的影响聚合物组成的影响 Dextran 分子量（粘度高，价格）。分子量（粘度高，价格）。PEG分子量分子量

7、(2)(2)聚合物浓度影响聚合物浓度影响 密度，密度差，粘度，粘度差，表面张力。密度，密度差，粘度，粘度差，表面张力。上述参数随聚合物浓度变化。上述参数随聚合物浓度变化。（3）盐与缓冲液）盐与缓冲液 A 盐离子的不均匀分配改变两相间电位差盐离子的不均匀分配改变两相间电位差 B 高盐浓度引起盐析效应高盐浓度引起盐析效应（4）pH lgKi*=lgKi+Zi ,等电点测定等电点测定（5）温度的影响温度的影响(离开临界点远，不太敏感，粘度离开临界点远，不太敏感，粘度)（6）荷电成相聚合物荷电成相聚合物葡聚糖分子量对蛋白质分配影响PEG分子量对蛋白质分配的影响无机盐对分配的影响低盐浓度对蛋白质分影配的

8、高盐浓度对蛋白质分配的影响等电点测定19.6 双水相系统的应用双水相系统的应用(1)蛋白质纯化(2)酶相转移催化(3)小分子分离A氨基酸B有机酸B抗生素C天然植物成分目前已知的胞内酶约目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。种，但投入生产的很少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离的方法，但非常困难。的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以双水

9、相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。及酶的进一步精制。1.双水相萃取法常用于胞内酶提取。双水相萃取法常用于胞内酶提取。四、双水相萃取的应用四、双水相萃取的应用双水相萃取技术目前较多地应用于胞内酶的提双水相萃取技术目前较多地应用于胞内酶的提取和精制上。取和精制上。要成功地运用双水相萃取法，应满足下列条件：要成功地运用双水相萃取法，应满足下列条件：(1)欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；(2)酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过经过次萃取，就能得到较高的收率；次萃取，就能得到较高的收率；(3)

10、两相用离心机很容易分离。两相用离心机很容易分离。双水相提取胞内酶的具体操作双水相提取胞内酶的具体操作基本流程：（图、表）基本流程：（图、表）1.萃取和平衡萃取和平衡（虽黏度高，但表面张力低，故时间短、能耗小）（虽黏度高，但表面张力低，故时间短、能耗小）2.上下相的分离上下相的分离 (1)重力沉降重力沉降 (2)离心分离（图）离心分离（图）3.多聚物的分离多聚物的分离（加盐，形成新的双水相，蛋白质入盐相，（加盐，形成新的双水相，蛋白质入盐相，PEG得得 回收，再将盐相超滤或透析除去少量回收，再将盐相超滤或透析除去少量PEG）工艺方面的问题v两水相分离条件v（1）目的分子与细胞应分配在不同的相v（

11、2）分配系数应足够大v（3）离心机容易分离19.7 成相聚合物的回收成相聚合物的回收(1)压力敏感型两水相(2)热促相分离高聚物EO-PO(3)pH敏感型高聚物（聚两性离子高聚物，多聚电解质)热诱导相分离相体系回收示意图pH诱导相分离 19.8 两水相萃取过程的放大与设备两水相萃取过程的放大与设备特征：A相粘度（与传质及相分离有关）B低表面张力（选择搅拌与混合装置）两水相技术研究进展两水相技术研究进展(1)廉价相体系的开发(2)两水相萃取转化(3)亲和两水相双水相苹取技术的发展双水相苹取技术的发展 双水相萃取应用得最多的是胞内酶的提取。双水相萃取应用得最多的是胞内酶的提取。这种温和的萃取不仅有

12、利于保护目的物的生物活这种温和的萃取不仅有利于保护目的物的生物活性，而且目的蛋白得率高，纯度高，但目的物还含性，而且目的蛋白得率高，纯度高，但目的物还含有少量的核酸和多糖，进一步提高目的蛋白的纯度，有少量的核酸和多糖，进一步提高目的蛋白的纯度，可从双水相体系和萃取操作方式两方面进行改进。可从双水相体系和萃取操作方式两方面进行改进。PEG衍生物：在衍生物：在PEG上引入亲和基团或离子基团；上引入亲和基团或离子基团；采用多级萃取。采用多级萃取。在两水相系统中进行转化翻译功能，如在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提

13、高了产率。这实消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果发生的是时也称为萃取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相而此时也可以把两水相系统称为两水相反应器。反应器。要进行两水相生物转化反应应满足下列条件：要进行两水相生物转化反应应满足下列条件：催化剂应单侧分配；催化剂应单侧分配；底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，一相中；要有合适

14、的相比。如产物分配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。则相比要大，反之则相比要小。这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，因此这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，因此常需要根据试验选择最优系统和操作条件。常需要根据试验选择最优系统和操作条件。采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的扩与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的扩散阻力，故反应速度较快，生产能力较高；散阻力，故反应速度较快，生产能力较高；生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间表面张力低，生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间

15、表面张力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液滴在轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液滴在10m m以以下，有很大的表面积，有利于底物和产物的传递。下，有很大的表面积，有利于底物和产物的传递。实例萃取反应示意PEG分子量对7-ADCA分配的影响7-ADCAandcephalexin盐的影响系线长度的影响添加剂的影响两水相中与单水相中的反应比较思考题思考题1理解概念：双结线，系线，结点，临界点，道南效应。2从分子相互作用的机理出发，理解两水相体系的形成。3在两水相加入无机盐如何影响物质的分配？v1两水相萃取应用中最突出的问题是什么？v如何解决？v2在两水相进行生物催化反应有何意义？v3两水相萃取生物小分子与萃取大分子有何v不同之处？4影响生物分子在两水相中分配的因素有哪v些？