第五章细胞融合与单克隆抗体1025课件.ppt
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1、1第五章第五章 细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体2本章主要内容:本章主要内容:细胞融合的基本概念细胞融合的基本概念人工诱导细胞融合技术人工诱导细胞融合技术杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选细胞杂交瘤技术与单克隆抗体细胞杂交瘤技术与单克隆抗体人源单克隆抗体人源单克隆抗体3细胞融合(细胞融合(cell fusion),是指在离体条件下将不同种生物或同是指在离体条件下将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。的技术。细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生!一、细胞融合的定一、细胞融合的定义义45自发细胞融合自发细
2、胞融合(一)细胞膜融合 受精过程(二)体内细胞的自发融合 1、肌管的形成 2、胚胎着床 3、巨细胞和破骨细胞的形成 4、肿瘤细胞的融合6显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程7二、人工诱导细胞融合 诱导细胞融合的主要方法有:病毒诱导融合 化学融合剂诱导融合 物理方法(电融合)8二、人工诱导细胞融合(一)病毒诱导的细胞融合 有许多种类的病毒能介导细胞融合,如疱疹病毒、副粘液病毒、鸡新城疫病毒等。其中最常用的是灭活的仙台病毒(HVJ),为RNA病毒。9灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜连接细胞融合,形成杂种细胞细胞融合
3、,形成杂种细胞(细胞膜具有一定的流动性)(细胞膜具有一定的流动性)生物法:生物法:灭活的病毒灭活的病毒(丧失感染性、保留抗原结构)(丧失感染性、保留抗原结构)10病毒促使细胞融合的主要步骤:病毒促使细胞融合的主要步骤:1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近;2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透,胞质互相渗透;3.两个原生质体的细胞核互相融合,两个细胞融为一体;4.进入正常的细胞分裂途径,分裂成含有两种染色体的杂种细胞。11化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物(如甘油-醋酸酯、油酸、油胺等)、脂质体(如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸等)、钙离子、水溶性高分子化合物(如聚乙二醇
4、)、水溶性蛋白质和多肽(如牛血清白蛋白、多聚L-赖氨酸等),其中最常用的是聚乙二醇(PEG)。1、聚乙二醇(PEG)法 2、Ca2+法 3、溶血卵磷脂 优点是易得,用法简单,融合效果稳定。(二二)化学方法诱导细胞融合化学方法诱导细胞融合12PEG的作用机理的作用机理:由于由于PEG分子具有轻微的负极性,分子具有轻微的负极性,故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成形成H键,从而在在质膜之间形成分子桥,其结果是使键,从而在在质膜之间形成分子桥,其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合;另外,细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合;另外,
5、PEG能能增加类脂膜的流动性,也使细胞的核、细胞器发生融合增加类脂膜的流动性,也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。成为可能。PEG诱导融合的特点诱导融合的特点:其优点是融合成本低,勿需特殊其优点是融合成本低,勿需特殊设备;融合子产生的异核率较高;融合过程不受物种限制。设备;融合子产生的异核率较高;融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐,其缺点是融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害。可能对细胞有毒害。13聚乙二醇(聚乙二醇(PEG)法)法细胞融合步骤细胞融合步骤(1)将两种不同亲本细胞各5l06混匀;(2)离心沉淀,吸去上清液;(3)加1ml 50PEG溶液,用吸管吹打,使之与细胞接触1分
6、钟;(4)加9ml 培养液,离心沉淀,吸去上清液;(5)加5ml 培养液,分别接种5个直径60mm平皿,每个平皿加培养 液至 5ml,37的CO2培养箱中培养。(6)624小时后,换成选择培养液筛选杂交细胞。14(三)物理方法诱导细胞融合(三)物理方法诱导细胞融合 电融合法是电融合法是80年代出现的细胞融合技术,在直流电脉冲的年代出现的细胞融合技术,在直流电脉冲的诱导下,细胞膜表面的氧化还原电位发生改变,使异种细胞粘诱导下,细胞膜表面的氧化还原电位发生改变,使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭和成完整合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭和成完整的膜,形成融合体。
7、的膜,形成融合体。电融合法的优点:电融合法的优点:u融合率高、重复性强、对细胞伤害小;融合率高、重复性强、对细胞伤害小;u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程;装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程;u免去免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。15电融合的基本过程:电融合的基本过程:细胞膜的接触:细胞膜的接触:当原生质当原生质体置于电导率很低的溶液中体置于电导率很低的溶液中时,电场通电后,电流即通时,电场通电后,电流即通过原生质体而不是通过溶液,过原生质体而不是通过溶液,其结果是原生质体在电场作其结果是原生质体在电场
8、作用下极化而产生偶极子,从用下极化而产生偶极子,从而使原生质体紧密接触排列而使原生质体紧密接触排列成串;成串;膜的击穿:膜的击穿:原生质体成串原生质体成串排列后,立即给予高频直流排列后,立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿,脉冲就可以使原生质膜击穿,从而导致两个紧密接触的细从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。胞融合在一起。电融合诱导法原理示意图电融合诱导法原理示意图16三、杂种细胞的筛选三、杂种细胞的筛选根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型,可根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型,可将其分为以下几种类型:将其分为以下几种类型:u异核细胞:非同源细胞的融合体。u同核细胞:两个相同细胞的
9、融合体。u多核细胞:含有双亲不同比例核物质的融合体。17u基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选u具有所需性状杂种细胞的筛选常用的杂种细胞筛选方法常用的杂种细胞筛选方法18细胞融合的意义细胞融合的意义u理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。u融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,为远缘物种间融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,
10、为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组,从而产生新亦可发生重组,从而产生新 的核外遗传系统。的核外遗传系统。u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。19四、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体四、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体2021 免疫器官免疫器官:免疫细胞生成、成熟或集中分布的场所,包括骨髓、胸腺、脾、淋巴结等 免疫细胞免疫细
11、胞(发挥免疫作用的细胞):1吞噬细胞 2淋巴细胞(起源骨髓中的造血干细胞)T细胞(在胸腺中成熟)B细胞(在骨髓中成熟)免疫活性物质免疫活性物质:由免疫细胞或其他细胞产生的发挥免疫作用的物质,包括抗体、淋巴因子、溶菌酶等 2223基本概念v抗原v抗体v抗原决定簇(抗原表位)v细胞克隆v多克隆抗体v单克隆抗体24抗原(抗原(antigenantigen,AgAg),),是指一种能刺激人或动物机是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞,并能与这些产物在体内体产生抗体或致敏淋巴细胞,并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本性质具有抗原的基本性质具有
12、异物性、大分子性和特异性异物性、大分子性和特异性。异物性异物性是指进入机体组织内的抗原物质,必须与该机体组织细胞的成分不相同。大分子性大分子性是指构成抗原的物质通常是相对分子质量大于10000的大分子物质,分子量越大,抗原性越强。特异性特异性是指一种抗原只能与相应的抗体或效应T细胞发生特异性结合。25v抗体(抗体(antibody,Abantibody,Ab)是机体是机体免疫系统免疫系统在在抗原抗原刺激下,刺激下,由由B B细胞或记忆细胞增殖分裂成浆细胞所产生的可与细胞或记忆细胞增殖分裂成浆细胞所产生的可与相应抗原发生特异性结合的相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白免疫球蛋白。v主要存在于血清等
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