第八章克隆基因的表达课件.ppt
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- 第八 克隆 基因 表达 课件
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1、第八章第八章-克隆基因的表达克隆基因的表达遗传信息从遗传信息从DNA到蛋白质到蛋白质的传递过程的传递过程-中心法则。中心法则。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞:宿主细胞:原核细胞或真核细胞。原核细胞或真核细胞。三、制约目的基因表达的因素:三、制约目的基因表达的因素:1.外源基因是否插入在正确的阅读框架外源基因是否插入在正确的阅读框架2.目的基因的有效转录(如启动子的作用)目的基因的有效转录(如启动子的作用)3.mRNA的有效转录(如
2、的有效转录(如S-D序列等作用)序列等作用)4.转录后,翻译后的适当的修饰和加工过程转录后,翻译后的适当的修饰和加工过程所谓所谓表达体系表达体系,是由,是由目的基因目的基因、表达载体表达载体与与宿主细胞宿主细胞组成的完整体系组成的完整体系四、在原核细胞内正确表达的基本条件:四、在原核细胞内正确表达的基本条件:必须能够必须能够正常地转录和翻译正常地转录和翻译1.外源基因外源基因不能带有间隔序列不能带有间隔序列(内含子)(内含子)真核基因必须用真核基因必须用cDNA或全化学合或全化学合成基因,不能用基因组成基因,不能用基因组DNA2.必须利用原核细胞的必须利用原核细胞的强启动子强启动子和和S-D序
3、列序列等调等调 节元件控制外源基因的表达节元件控制外源基因的表达3.外源基因和表达载体连接后,必须形成外源基因和表达载体连接后,必须形成正确的阅读框架正确的阅读框架阅读框架阅读框架:由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列4.通过通过表达载体表达载体将外源基因导入宿主菌,并指导将外源基因导入宿主菌,并指导宿主菌的宿主菌的 酶系统酶系统合成外源蛋白合成外源蛋白表达载体:表达载体:适合在受体细胞内表达外源基因的载体适合在受体细胞内表达外源基因的载体5.利用宿主菌的利用宿主菌的调控系统调控系统,调节外源基因表达,防止外源,调节外源基因表达,防止外源 基因表达产物对
4、宿主菌毒害基因表达产物对宿主菌毒害用原核生物作宿主用原核生物作宿主A dividing E.coli原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动子MCSSD序列序列终止子终止子识别原核细胞的识别原核细胞的启动子启动子,催化所有的,催化所有的RNA合成。合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。表达的协同单位。2.以操纵子为单位以操纵子为单位1.只有一种只有一种RNA多聚酶多聚酶有意义链有意义链5反意义链反意义链3转录转录mRNA53翻译翻译蛋白质蛋白质NC534.不含内含子,缺乏转录后的加工系统。不含内含子,缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在
5、转录水平上。调控主要在转录水平上。含有一个启始密码子和一段同核糖体含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端末端碱基互补的序列,叫碱基互补的序列,叫Shine-Dalgarno(S-D)序列)序列。6.mRNA的核糖体结合位点的核糖体结合位点 外源基因不能带有内含子外源基因不能带有内含子2.必须用必须用cDNA3.不能直接用真核基因组不能直接用真核基因组DNA4.必须利用原核细胞的调控原件(启动子等)必须利用原核细胞的调控原件(启动子等)5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害防止外源基因产物对宿主细胞的毒害是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的
6、序列。合成的序列。大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序(consensus sequence)。)。1.启动子启动子-35 Box 和和-10 Box(1)启动子序列启动子序列 5-TTGACA-35-TATAAT-3-10box(Pribnow Box)TTGACATATAAT 转录起始位点转录起始位点17bp5核糖体结合位点核糖体结合位点RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点。核糖体结合位点(核糖体结合位点(RBS)1)Shine-Dalgarno(SD)sequence:mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。ri
7、bosome binding sitemRNA 5AGGAGGUAUG16S rRNA3UCCUCCAS-D序列距离序列距离AUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译AUG(91%)GUG(8%)UUG(1%)位于位于SD序列下游。序列下游。全酶是一个全酶是一个5聚体,含有两个聚体,含有两个小亚基小亚基,和,和2两个大两个大亚基(亚基(和和),一个),一个亚基。亚基。大肠杆菌只有一种类型的大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录多聚酶转录tRNA,rRNA和和mRNA。(1)结构)结构内终止子内终止子 intrinsic terminator:E.coli中促使转录终止的中促使转录终止的DNA位置有
8、一段位置有一段反反向回文顺序向回文顺序,其后紧接一串,其后紧接一串A,称为内终,称为内终止子,形成终止信号。止子,形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对,稳定性比较的配对,稳定性比较差,有利于转录物脱落而不利于转录延续。差,有利于转录物脱落而不利于转录延续。反向回文顺序被转录后,立即形成一个茎环结反向回文顺序被转录后,立即形成一个茎环结构,使转录物与模板之间配对的碱基数降低,构,使转录物与模板之间配对的碱基数降低
9、,整个减弱了整个减弱了RNA 与与DNA的互作的互作 茎环结构茎环结构 多聚多聚A/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)转录转录5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠折叠mRNA折叠折叠U CCU GGCAUCGCGGCCGCGGCA ACCCAC UUUU3DNARNA聚合酶聚合酶脱落脱落大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上。一般安置上全部的三个终止全部的
10、三个终止密码密码防止核糖体跳跃(防止核糖体跳跃(skipping)。)。Translation enhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。效率的特殊序列。T7噬菌体基因噬菌体基因10前导序列(简称前导序列(简称g10-L序列)序列);大肠杆菌大肠杆菌atpE基因基因mRNA5-UTR中富含中富含U的区段。的区段。21 必须是一种强启动子必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的白的10%-30%以上。以上。应呈现低水平的基础转录应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。便于
11、表达毒性蛋白等。应是可诱导型的应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂诱导。来自大肠杆菌的乳来自大肠杆菌的乳糖操纵子。糖操纵子。用乳糖或其类似物用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物,充当诱导物,与阻遏蛋白结合,与阻遏蛋白结合,解除抑制。解除抑制。Plac O 目的基因目的基因四聚体的四聚体的阻遏物阻遏物阻遏物作用区阻遏物作用区CAP作用区作用区RNA聚合酶作用区聚合酶作用区组成:组成:长度:长度:203bp的的HaeIII片断片断(包括(包括-半乳糖苷酶的前半乳糖苷酶的前8个密码)。个密码)。“可移动的可移动的lac启动子小片断启动子小片断”IPTG有毒、昂有毒、昂贵,不理想。贵,不
12、理想。IPTG=异丙基硫异丙基硫代代-D半乳糖半乳糖trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpAtrpR阻遏蛋白基因;阻遏蛋白基因;P1P2启动子;启动子;O操纵基因;操纵基因;衰减子衰减子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA邻氨基苯甲邻氨基苯甲酸合成酶酸合成酶吲哚甘油吲哚甘油磷酸合成酶磷酸合成酶色氨酸色氨酸合成酶合成酶 链链 链链分支酸分支酸邻氨基邻氨基苯甲酸苯甲酸磷酸核糖基磷酸核糖基邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘吲哚甘油油-磷酸磷酸色氨酸色氨酸阻遏物阻遏物转录转录(P1是主要启动子,
13、是主要启动子,P2的作用只有的作用只有3%)没有色氨酸时,阻遏蛋白不能与操纵基因结合,没有色氨酸时,阻遏蛋白不能与操纵基因结合,能转录合成色氨酸所需要的酶。能转录合成色氨酸所需要的酶。trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA阻遏物阻遏物色氨酸色氨酸结合结合不转录不转录用于表达载体的用于表达载体的trp启动子一般只包含启动启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分基因、操纵基因、和部分trpE基因。基因。P1OtrpE目的基因目的基因有色氨酸时,阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操有色氨酸时,阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合,从而阻止色氨酸合成酶类的转录纵基因结合,从而阻
14、止色氨酸合成酶类的转录是从是从 噬菌体中得到的一类启动子,比噬菌体中得到的一类启动子,比lac启启动子的活性高动子的活性高8-10倍,比倍,比trp启动子活性高。启动子活性高。cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcIIN:抗终止蛋白;抗终止蛋白;Cro:抗阻遏蛋白抗阻遏蛋白(裂解必需的);裂解必需的);cI,cII,cIII:阻遏蛋白;阻遏蛋白;P:启动子;启动子;O:操纵子。操纵子。R:右;右;L:左左cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcII阻遏物阻遏物转录转录转录转录转录转录当当cI合成后,与合成后,与OL和和OR结合阻止结合阻止RNA聚合酶,则左
15、右基因都受到抑制。但促聚合酶,则左右基因都受到抑制。但促进进PM使使cI进一步转录。进入溶原期。进一步转录。进入溶原期。早期左边早期左边早期右边早期右边表达载体常用的噬菌体启动子是表达载体常用的噬菌体启动子是PL。调节基因调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的突变则是选择了一个温度敏感性的突变基因基因cI857。整合在宿主基因组里,或克隆到载体上。整合在宿主基因组里,或克隆到载体上。42oC时阻遏蛋白失活,外源基因大量转录时阻遏蛋白失活,外源基因大量转录PL外源基因外源基因28oC时阻遏时阻遏PL,外源基因不转录。,外源基因不转录。1.细胞质中表达细胞质中表达(1)包涵体()包涵体(incl
16、usion body)是存在于细胞质中的一种是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质不溶性蛋白质聚聚集折叠而成的晶体结构物。集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。形成原理未知。例:例:使重组蛋白易于分离、免受蛋白使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞。酶降解、不损害寄主细胞。回收的蛋白生物活性差。回收的蛋白生物活性差。缺点缺点 优点优点(1)周质()周质(periplasm)格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚的复杂机理目前不完全清楚优点:优点:容易
17、被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少、具有完全生物学活性的重组蛋白。解的少、具有完全生物学活性的重组蛋白。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶(内酰胺酶(lactamase)、)、肠毒素(肠毒素(enterotoxin)ST-II、LT-B等等 大肠杆菌的信号肽:大肠杆菌的信号肽:能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。切割掉。(2)信号肽()信号肽(signal peptide)一般位于一般位于N端。端。鼠源鼠源RNase、人生长激素信号肽。、人生长激素信号肽。也能在细菌中起作用
18、。也能在细菌中起作用。胡萝卜欧氏杆菌的胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。蛋白。金黄色葡萄球菌的蛋白金黄色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 (endoglucanase)。)。由于需要穿过两层膜,大肠杆菌只能分泌极由于需要穿过两层膜,大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中,效果都不太理想。少的蛋白质到培养基中,效果都不太理想。用溶血素基因构建分泌性融合蛋白;用溶血素基因构建分泌性融合蛋白;使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到分泌到细胞外细胞外的培养基中。的培养基中。或与细菌素释放蛋白共表达。或与细菌素释放蛋白共表达。载体表达出的
19、外源基因蛋白质不与载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。细菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列序列ATG-外源基因外源基因-TAG优点优点:1.非融合型表达载体非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点:缺点:容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。哈佛大学的哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。实验室建立的。表达能力强。组成结构:组成结构:强启动子强启动子:tac(trp-lac):trp的的-35区区lacUV5的的-10区区lac操纵基因操纵基因 操纵基因:操纵基因:乳糖操纵子系统。
20、乳糖操纵子系统。终止子:终止子:调节基因:调节基因:Lac I宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如JM105菌菌rrnB的强终止子的强终止子rrnB强终止子强终止子S-D插入位点区插入位点区S-D序列和插入位点区:序列和插入位点区:tac PLac O S-D 插入位点区插入位点区rrnB T宿主宿主lac I载体的其余部分:载体的其余部分:来自来自pBR322质粒。质粒。表达诱导物:表达诱导物:IPTG(乳糖的类似物,不会被降解)(乳糖的类似物,不会被降解)阻遏物阻遏物IPTG必须选择一个有必须选择一个有lacI的宿主菌。的宿主菌。条件:条件:载体表达出的外源
21、蛋白质与细菌的分泌信号肽载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起,可被宿主菌分泌到细胞周质中。连在一起,可被宿主菌分泌到细胞周质中。如:如:pIN III系列:系列:pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,(1)组成结构)组成结构Ipplac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点插入位点 Ipp(脂蛋白基因启动子)和(脂蛋白基因启动子)和lacUV5 启动子。启动子。调节基因:调节基因:lac I S-D序列和起始密码序列和起始密码ATG。分泌信号肽:分泌信号肽:大肠杆菌外膜蛋白基因大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。插入位点区(多克
22、隆位点)。插入位点区(多克隆位点)。强启动子:强启动子:以以pBR322为基为基础构建的。础构建的。调节基因不必调节基因不必借助于宿主的借助于宿主的lacI.表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。菌体蛋白连接在一起的。启动子:启动子:tac操纵基因:操纵基因:lacP调节基因:调节基因:lacIS-D序列序列(1)优点)优点(2)组成结构)组成结构便于融合蛋白的分离和纯化。便于融合蛋白的分离和纯化。22lacItac lac O S-D/ATG GST 插入位点插入位点 TGAlacPori:pBR322 ori融合肽:融合肽:G
23、ST(谷胱甘肽巯基转移酶)谷胱甘肽巯基转移酶)GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathione Sepharose亲亲和层析柱和层析柱分离纯化。分离纯化。用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从因子可以把外源蛋白从GST上切下来上切下来柱(柱(columncolumn)GSTGST 外源蛋白外源蛋白凝血酶凝血酶外源蛋白外源蛋白柱(柱(columncolumn)GSTGSTGSTGST洗脱洗脱柱(柱(columncolumn)可再利用可再利用插入区:插入区:pGEX-1 TCTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGAL
24、eu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACGLeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGACIle Glu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser SerEcoR IBam
25、H IXa因子因子pGEX-2X的插入区:的插入区:pGEX-3X的插入区:的插入区:Sma ISma IHis-tag(组氨酸标签):(组氨酸标签):在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨酸个组氨酸(His)。)。His-tag能与能与Ni2+柱柱结合,但很容易被结合,但很容易被EDTA(或咪(或咪唑溶液)洗脱下来,可以纯化蛋白质。唑溶液)洗脱下来,可以纯化蛋白质。溴化氰溴化氰Cyanogen bromide:5-TTGACA-35-TATAAT-3-35box-10box(Pribnow Box)1.启动子的结构对表达效率的影响启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶聚合
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