最新基因工程的操作程序1课件.ppt
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1、1 1、原核细胞的基因结构、原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子RNARNA聚合酶聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质蛋白质.基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取(一一)、目的基因主要
2、是、目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子(二)、获取目的基因的常用方法有哪些(二)、获取目的基因的常用方法有哪些?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受体菌的群体中,片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库基因,称
3、为基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库(如(如:cDNA文库)文库)(1 1).基因文库基因文库基因组文库的构建基因组文库的构建(2 2).基因文库的构建方法基因文库的构建方法通过对受通过对受体菌的培体菌的培养而储存养而储存基因基因 cDNA文库的构文库的构建建-反转录法:反转录法:以目的基因转以目的基因转录成的信使录成的信使RNARNA为模为模板,反转录成互补板,反转录成互补的单链的单链DNADNA,然后在,然后在酶的作用下合成双酶的作用下合成双链链DNADNA,从而获得所,从而获得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADN
4、A反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA(目的基因目的基因)基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较怎样从基因文库中得怎样从基因文库中得到我们所需的目的基到我们所需的目的基因呢因呢?依据:目的基因的有关信息。依据:目的基因的有关信息。如:根据基因的核苷酸序列如:根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性从基因文库中得到目的基因的方从基因文库中得到目的基因的方法法2 2、利用、利用PCRPCR技术扩
5、增目的基因技术扩增目的基因 概念概念:PCRPCR全称为全称为_,是一项,是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件:条件:_、_、_ _、_._.前提条件:前提条件:原理:原理:_方式:以方式:以_方式扩增,即方式扩增,即_(n n为扩增为扩增循循 环的次数)环的次数)结果:结果:聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
6、过程:过程:a a、DNADNA变性变性(90-9590-95):双链):双链DNADNA模板模板 在热作用下,在热作用下,_断裂,形成断裂,形成_b b、退火、退火(复性复性55-6555-65):系统温度降低,引):系统温度降低,引 物与物与DNADNA模板结合,形成局部模板结合,形成局部_。c c、延伸、延伸(70-7570-75):在):在TaqTaq酶的作用下,酶的作用下,合成与模板互补的合成与模板互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链3、人工合成法:、人工合成法:基因较小,核苷酸序列已知,可以基因较小,核苷酸序列已知,可以利用利用DNA合成仪人工合成合成仪人
7、工合成二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的:、目的:所需物质:所需物质:使目的基因在受体细胞中稳定存在,使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因能够表达和发挥作用。它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?2 2、基因表达载体的组成:、基因表达载体的组成:复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?启动子:启动子:位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断,它是片
8、断,它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位,有了它才能位,有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA,最终获得蛋白质,最终获得蛋白质终止子:终止子:位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断,片断,能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因,从而将有目的基因的细因,从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来载体载体与与表达载体表达载体的区别:二者都有标记基因的区别:二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体
9、片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构分结构用到的工具酶:用到的工具酶:既用到限制酶切割载体,又既用到限制酶切割载体,又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接,两种连接酶将目的基因和载体拼接,两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞,目的基因不能单独进入受体细胞,必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意三将目的基因导入受体细胞三将目的基因导入受体细胞(一)转化:(一)转
10、化:(二)方法(二)方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内,并且在内,并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法:、将目的基因导入植物细胞的方法:(1)农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点:农杆菌特点:易感染双子叶植物和裸子植物,对大多易感染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没
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