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1、基因工程基本原理简介基因工程基本原理简介第一节第一节 基因工程原理简介基因工程原理简介一、基因工程的定义一、基因工程的定义 本义：本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此目的基因在宿主体

2、内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的研究目的基因基因/DNA片段片段的结构与功能，或获得该基因的表达的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。产物。这一过程就是基因工程。广义：广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。属于基因工程的范畴。家蝇部分基因组文库构建、卵黄蛋白基因家蝇部分基因组文库构建、卵黄蛋白基因启动子克隆与初步应用研究启动子克隆与初步应用研究Cloning and initial application of functional promoter of Musca domestica

3、yolk protein gene启动子克隆一般思路启动子克隆一般思路启动子区启动子区杂交杂交增强子增强子调控启动子调控启动子核心启动子核心启动子基因基因3 5转录起始点转录起始点探针探针+50-40ATG-4000-500功能功能 分析分析 克隆启动子克隆启动子实验一、家蝇部分基因组文库的构建实验一、家蝇部分基因组文库的构建 1 材料与方法材料与方法 1.1 家蝇基因组家蝇基因组DNA的提取的提取 2.1 基因组基因组DNA的部分酶切的部分酶切 3.1 EMBL3载体臂的制备载体臂的制备 4.1 连接与包装连接与包装 5.1 基因组文库鉴定基因组文库鉴定 Bcl I随机酶切随机酶切 左臂左臂

4、 基因组基因组DNA 右臂右臂 left arm（20kb）central stuff 14kbright arm9kbEcoR IBamH ISal IBamHSal IEcoR I基因组基因组DNABamH I+CIPBcl IBcl IBamH IBamH I包包装装转化转化KW251噬菌斑噬菌斑 101023kb23kb包装蛋白包装蛋白实验一、技术路线图重组噬菌体重组噬菌体收集收集噬菌体液噬菌体液基因组文库基因组文库1.Genomic DNA2.Lamba DNA Fig.1 electrophoresis of genomic DNA图图1.1.基因组基因组DNADNA电泳电泳1 2

5、48.5kb 实验一结果实验一结果2.1 基因组基因组DNADNA的提取的提取提取的基因组提取的基因组 DNA 大于大于50kbFig.2 Digestion of genomic DNA by Bcl I1.5U/ugDNA Bcl I，2.2.5U/ugDNA Bcl I3.1.25 U/ugDNA Bcl I4.Lamba DNA/Hind Marker Marker图图2.基因组基因组DNA Bcl I 酶切电泳酶切电泳23kb 9.4kb1 2 3 4Fig.3 Electrophoresis of recover products of 1023kb DNA fragments 1

6、.Bcl I 酶切纯化片段 2.Lamba DNA/Hind Marker图图3.101023kb DNA23kb DNA片段回收产物电泳片段回收产物电泳23kb9.4kb 1 2 实验一结果实验一结果 2.2 家蝇基因组家蝇基因组DNA酶切和纯化酶切和纯化纯化了纯化了1023kb的的Bcl I酶切酶切DNA片段片段实验二、实验二、家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆和序列分析和序列分析 特异性探针特异性探针噬菌斑原噬菌斑原位杂交位杂交鉴定鉴定可疑阳性克隆可疑阳性克隆亚克亚克 隆隆文库液文库液转化转化KW251噬菌斑噬菌斑三次纯化三次纯化噬菌斑原噬菌斑原位杂交位杂交-DNA

7、 提提 取取 阳性克隆阳性克隆单酶切和单酶切和双酶切双酶切Southern BlototHind IIIHind IIIXhoIXhoI目的目的DNA片段片段测序测序序列分析序列分析实验二、技术路线实验二、技术路线实验二结果实验二结果GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAA CAAGAAGTCA CCGTTTTCATCACCGGTCTG CCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAA

8、AAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGT

9、TTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCC

10、GGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC卵黄蛋白基因部分卵黄蛋白基因部分DNA片段特异性探针序列片段特异性探针序列2.1 特异性探针制备特异性探针制备 制备了大小为制备了大小为768bp的地高辛标记的的地高辛标记的DNA片段特异性探片段特异性探针，工作浓度为针，工作浓度为1：2000。实验二结果实验二结果 2.2 阳性克隆的筛选和纯化阳性克隆的筛选和纯化1#positive clone（about 2000 plaques/plate）Fig.3 Screen

11、ing result of 1st round situ hybridization图图3 第一次噬菌斑原位杂交第一次噬菌斑原位杂交筛选结果筛选结果YP1 2#positive clone（about 200 plaques/plate）Fig.4 Screening result of 2nd round situ hybridization图图4 第二次噬菌斑原位杂交筛第二次噬菌斑原位杂交筛选结果选结果Numbers：11 positive clone（11 plaques/plate）Fig.5 Screening result of 3rd round situ hybridizati

12、on图图5 第三次噬菌斑原位杂交筛选第三次噬菌斑原位杂交筛选结果结果获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆2.0 2.3 4.4 6.6 9.423 1.4 1.6 2.0 3.5 4.3 5.0 21 1 2 3 4 5 6 kb kb Fig.6 Digestion analysis of recombinant-DNA of positive plaque图图6 阳性克隆阳性克隆-DNA的酶切分析的酶切分析实验二结果2.3 mdYP基因组基因的克隆基因组基因的克隆1:Lambda DNA/Hind Marker 2:Xho,3:Xho/Hind,4:Hind

13、,5:Sal6:DNA/EcoR+Hind Marker3.5 kb 1 2 4 1:Xho I，2:Hind 3:Xho/Hind Fig.7 Southern blot of recombinant -DNA of positive plaque with mdYP1 DNA probe DIG-labeled 图图7 阳性克隆阳性克隆-DNA的的 Southern blot实验二结果2.3 mdYP基因组基因的克隆基因组基因的克隆 1 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTG

14、TGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100 101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200 201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300 301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCG

15、ATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400 401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500 501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600 601 TTTAAATAAGAAATAATATATA

16、TATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700 701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800 801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900

17、 901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 10001001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 11001101 CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAA

18、TTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 12001201 TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA 13001301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCAATCAATTCT 14001401 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACG

19、TAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 15001501 TATCAGCAGTTCTCGCTTAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGATATAAATATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG 16001601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGGAATCCATTGGGAG 17001701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTG

20、CCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA 18001801 GGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTC 19001901 AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 20002001 AGCAATGTCCCCGTC

21、TACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG 2100 获得了全长获得了全长3991bp的基因组序列，包含的基因组序列，包含1.7kb卵黄蛋白卵黄蛋白基因组基因及其基因组基因及其5-调控区序列。调控区序列。2101 AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG 22002201 CAAAAAACCCGAAGCACCC

22、CAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 23002301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG 24002401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTA

23、C 25002501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 26002601 TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 27002701 CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGG

24、CCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA 28002801 TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA 29002901 ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA 30003001 AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTG

25、AATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT 31003101 TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA 32003201 AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT 33003301 TTAG

26、AAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG 34003401 AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA 35003501 GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTC

27、TGACGATACTTACGTT 36003601 TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT 37003701 TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC 38003801 CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCC

28、TTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC 39003901 TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG 3991Fig.3 The sequence of Musca domestica YP1 gene containing 1.7kb 5flanking region.The intron region(18861947)is marked by underlining,the TATA box or

29、 the AATAA signal is in bold,The translation initiation codon ATG or translation termination codon TAG is indicated by an open box。图图3.卵黄蛋白基因组基因全序列卵黄蛋白基因组基因全序列实验三、实验三、家蝇卵黄蛋白基因启动子片段的家蝇卵黄蛋白基因启动子片段的 克隆与功能分析克隆与功能分析 FP1RP1或RP2PCRFP2FP3P2P2P3P3+753ATG+1启动子区启动子区FP4pMYP1-GFP3840bpHind IIIGFPNot IBamH ISpe I

30、POLY(A)TETMYP1pMYP2-GFP4238bpXba IGFPNot IBamH ISpe IHind IIIPOLY(A)TETMYP2pCMV-GFP4200 bpHind IIIGFPNot IBamH ISpe IPOLY(A)TETCMVP4P44720bpXba IGFPNot IBamH ISpe IHind IIIpMYP3-GFPPOLY(A)TETMYP34170bpXba IGFPNot IBamH ISpe IHind IIIpMYP4-GFPPOLY(A)TETMYP4P1P1实验三、技术路线图实验三、技术路线图pGFP3560 bpSpe IHind I

31、IIGFP补平T4 Ligase表达质粒构建表达质粒构建表达质粒构建表达质粒构建TATAHind IIIP2P3TATAHind IIIHind III 酶切P5P6pCMV-GFP4200 bpHind IIIGFPNot IBamH ISpe IPOLY(A)TETCMV3940bppMYP5-GFPHind IIIGFPNot IBamH ISpe IPOLY(A)TETMYP54320bppMYP6-GFPHind IIIGFPNot IBamH ISpe IPOLY(A)TETMYP6pGFP3560 bpSpe IHind IIIGFP补平T4 Ligase鉴鉴 定定电转移电转移转

32、染转染pMYP1-GFPpMYP2-GFPpMYP3-GFPpMYP4-GFPpMYP5-GFPpMYP6-GFP转染转染Sf9昆虫细胞昆虫细胞BHK-21细胞细胞家家蝇蝇卵卵绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白启启动动子子活活性性荧光显微镜荧光显微镜荧荧光光显显微微镜镜2.2 2.2 启动子片段的转录活性鉴定启动子片段的转录活性鉴定pMYP2-GFPpMYP2-GFP质粒电转移结果质粒电转移结果pMYP3-GFPpMYP3-GFP质粒电转移结果质粒电转移结果pMYP4-GFPpMYP4-GFP质粒电转移结果质粒电转移结果TE bufferTE buffer电转移电转移结果结果 实验三结果实验三结果家蝇早

33、期胚胎转基因前后的家蝇早期胚胎转基因前后的差异表达研究差异表达研究2.DD-PCR技术技术 5-NMAAAAAAAAAAAAA 5-NMAAAAAAAAAAAAAn n细胞总细胞总RNA或或poly(A)RNA 5-NMAAAAAAAAAAAAA5-NMAAAAAAAAAAAAAn n cDNA 3-N M TTTTTTTTTTTTN M TTTTTTTTTTTT 简简并锚定引物并锚定引物 进行进行PCR 随机十聚体随机十聚体 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTT NMTTTTTTTTTTTT持续循环持续循环 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NMTT

34、TTTTTTTTTTNMTTTTTTTTTTTT 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳样品样品A 样品样品B 作作Northern探针探针作作cDNA文库筛选探针文库筛选探针作亚克隆和测序样品作亚克隆和测序样品反转录反应反转录反应切取目的带切取目的带,重新扩增重新扩增,回收纯化回收纯化图图3.家蝇早期胚胎转基因前后家蝇早期胚胎转基因前后DD-PCR结果结果 1、3、5转基因处理组转基因处理组T11MA-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP42、4、6对照组对照组 T11A-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP4 图图4.差异片段的二次差异片段的二次PCR回收结果回收结果

35、 1DD-frag-62DD-frag-53DD-frag-3MDL2000 Marker DD-frag-3：355 nt GGTACTCCAGTACAACTGATATCGTATGTTGAAATTCCTGCCGTGAGCAAAGCTCCCTTTGTAATAATCAGTACCCAAGAACAGGCAAACAAATAAATAACAGTTCTAAGTGAAATAACTGATGATCTACTATACAAAACTTATAAAGAGATAATAAGGTATTCGGTAATAAAATAAAAAAATAGTAAAGGTGGGTTCTTACTAATTATTCATTCAATAATAATAATCGAATGTATT

36、ACTGCTCCCTAAATCAACTAAACAGTTCTAATAGAGTTGAGGGAATGCATGCAGTAATATTCCTGTTGTAAAATTGAATGAAGCTCCAAACCTGTTCCAATGCAGGAGTATATCTGGA DD-frag-5：432 nt GCAATCGATGTACGATGTTTAACAACAACAAGAGTAATTACACTTTCAATTTTCACTTGTCTAACCAAAATTCATGTTGTATGAATGTCAAAAAGAAAAGACGACGGGTAACAAAAATCGAAAGTGAGCAACAATCGATTCTGGTGACGACAAAATTCTTAAGC

37、AAGAAATCATCATCTTAAGAACGAAACAACTCATTGACCTAGAATGTTGATTGACAACTTAATGCTTCACCACTAGACATTACTCGTCAGCTGGTTACATCGATTGTTAAACGTTTTCAAATCGAAACACTAGAAGATGGATAACCCGTGATTGGCTTTTCGTATTAAAGATAGATGTAAATCAACCGCGAATTGTTCAACAACAACCAAGCAAAGGAATCAACTGAACACATATCAAAGAGTGTTTGGCACTTTATATAAATACTT DD-frag-6：240 ntGCAATCGATGTCACGA

38、TCGTAAGCGTTAACCAAAATTGCGTCCTCTAGAGATAGTATTCAACAAGCGATAATGGCCGTACTGAGGCAAATCTTTGTCATTCCCAAAAGTATGTTTCAGAAGCACCTTGGTAATAGTGCAAAATATAGGCCTTATTGAATTTTGACGAAATCTCTTTCATGATTTTAGTGCATCGATTGCATACAAACGCTCTTTTGTAAGCCAAGACATAGTTTCTCCA图图8 DD-frag-3（上）（上）、DD-frag-5（A）与）与DD-frag-6（B）点杂交鉴定结果点杂交鉴定结果 1阳性对照阳性对照 2.阴性对

39、照阴性对照 3.家蝇基因组家蝇基因组 1阴性对照阴性对照;2.家蝇基因组家蝇基因组;3转基因处理组转基因处理组;4.对照组对照组 三、重组质粒的构建与鉴定三、重组质粒的构建与鉴定 1.工具酶：限制性内切酶、连接酶、聚合酶及其他修饰酶等；工具酶：限制性内切酶、连接酶、聚合酶及其他修饰酶等；2.大肠杆菌感受态细胞；大肠杆菌感受态细胞；3.DNA的酶切与回收；的酶切与回收；1pIRES-EGFP5200bppCMVMCSIVSIRESEGFPPoly ACol E1Amp图图.pIRES-EGFP4.目的片段与载体的连接；目的片段与载体的连接；5.转化与重组质粒的鉴定；转化与重组质粒的鉴定；1）初步

40、鉴定：）初步鉴定：-互补互补；快速鉴定；原位杂交；快速鉴定；原位杂交；PCR；抗；抗性筛选；性筛选；2）酶切鉴定；）酶切鉴定；3）测序鉴定。）测序鉴定。四、提高表达效率的技术方法四、提高表达效率的技术方法 1.1.选用强启动子，如选用强启动子，如CMV、EF1等；等；2.2.增强子，如增强子，如MARMAR序列；序列；3.poly(A)3.poly(A)；4.4.组成型表达（可诱导表达）；组成型表达（可诱导表达）；5.Dhfr 5.Dhfr加压筛选系统；加压筛选系统；6.6.串联表达（融合表达）；串联表达（融合表达）；7.7.稳定表达（瞬时表达）；稳定表达（瞬时表达）；8.Kozak8.Koz

41、ak序列（序列（CCACCATGCCACCATG）；）；SDSD序列序列 9.9.密码子优化；密码子优化；10.10.联合应用几种方法。联合应用几种方法。五、阳性克隆筛选技术五、阳性克隆筛选技术 1.报告基因：报告基因：cat；LacZ；GFP；YFP；hGH；生长激素。；生长激素。2.抗性筛选：抗性筛选：Amp；Tetr；G418；潮霉素；氯霉素。；潮霉素；氯霉素。3.其其 他：他：MTX-DHFR；HGPRT。六、重组病毒构建技术（反向遗传学操作技术！）六、重组病毒构建技术（反向遗传学操作技术！）1.Ad2 vector 2.Baculovirus vector 3.RT-V vector

42、七、转基因方法与转基因动物七、转基因方法与转基因动物八、由真核生物蛋白质氨基酸序列获得其八、由真核生物蛋白质氨基酸序列获得其cDNA基因基因第五节第五节 基因工程中的最新技术基因工程中的最新技术一、克隆技术一、克隆技术二、蛋白质工程二、蛋白质工程三、生物芯片技术三、生物芯片技术四、抗体库与基因工程抗体四、抗体库与基因工程抗体五、五、RNAi and iPSProtein EngineeringProtein Engineering：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有目的的分子设计，或人工直接合系为基础，通过有目的的分子设计，或人工直

43、接合成蛋白质（多肽），或利用基因工程手段，对已知成蛋白质（多肽），或利用基因工程手段，对已知或未知蛋白质进行定向改造，获得比天然蛋白更优或未知蛋白质进行定向改造，获得比天然蛋白更优良、更符合人们需要的新型蛋白质的过程。良、更符合人们需要的新型蛋白质的过程。Huge MouseA transgenic mouse with an active rat growth hormone gene(left)is twice the size of a normal mouse(right).凡事之本，必先治身！凡事之本，必先治身！-吕氏春秋吕氏春秋先己先己不疾学而能为魁士名人者，未之尝有也！不疾学而能为魁士名人者，未之尝有也！-吕氏春秋吕氏春秋劝学劝学在科学的道路上，只有丰碑，没有路标！在科学的道路上，只有丰碑，没有路标！-爱因斯坦爱因斯坦 知识知识+智慧智慧+机遇机遇+奋斗奋斗+健康健康 成功成功!衣带渐宽终不悔，衣带渐宽终不悔，为为伊伊消得人憔悴。消得人憔悴。柳永（宋）柳永（宋）伊伊新解：新解：科学科学