最新43血红蛋白提取课件.ppt

1、2003年年4月月14日宣布人类基因组序列图完成日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。这标志着进入了后基因组时代。人类基因组：指人类基因组：指DNA分子所携带的全部分子所携带的全部遗传信息。遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究总和。主要是对蛋白质功能的研究 1、概念：在一定的范围内，能对抗外、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用

2、的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）对溶液的）对溶液的（）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（就可以制得（）使用的）使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3电泳：电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发生、概

3、念：指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。迁移的过程。思考：在血红蛋白的提取和分离实验中用思考：在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）和材料的科学研究（活性）2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有）等都具有()在在()下下，这些基团会带上，这些基团会带上（）。在电场的作用下

4、，这些。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身）以及分子本身（）、（）、（）的不同使带电分的不同使带电分子产生不同的（子产生不同的（），从而实现），从而实现样品中各种分子的分离。样品中各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH聚丙稀酰胺凝胶：聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交是由单体丙烯酰胺和交联剂联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺在

5、引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶聚合交联成三维网状结构的凝胶分类：分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定（测定（）通）通常用十二烷基硫酸钠（常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀聚丙稀酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量二二 实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞

6、白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链90目的：去除（目的：去除（）方法：方法：（）离心（速度越离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（吸管吸出上层透明的（），将下），将下层（层（）的红细胞液体倒入（）的红细胞液体倒入（）每个肽链环绕（每个肽链环绕（），此），此基团可携带（基团可携带（）。）。血红蛋白因含有（血红蛋白

7、因含有（）而呈红色。本课）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳一分子氧或一分子二氧化碳血红素血红素(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤杂质蛋白杂质蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯再加入再加入用（用（）的（）的（）质量分数为质量分数为0.9的氯化钠的氯化钠溶液洗涤溶液洗涤低速离心（低速短时间）低速离心（低速短时间）重复重复4、5步骤（步骤（）次，直至上清）次，直至上清液中已没有（液中已没有（），表明洗涤干净。），表明洗涤干净。利于

8、后续血红蛋白的分离纯化，不可洗利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。涤次数过少。五倍体积五倍体积生理盐水生理盐水三三黄色黄色(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放 加（加（）到（）到（）体积，）体积，再加再加40体积的（体积的（）（）（溶解细胞溶解细胞膜膜），置于（，置于（）上充分搅拌）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出细胞破裂释放出血红蛋白血红蛋白.(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以移到离心管内，以2000r/min的速度离心的速度离心10 min，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:原血液

9、原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固体第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶液层 （）的液体）的液体 第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色用滤纸过滤，用滤纸过滤，除去脂溶性沉除去脂溶性沉淀层，于分液淀层，于分液漏斗中静置片漏斗中静置片刻后，刻后，分出下分出下层的红色透明层的红色透明液体液体。取取()ml的血红蛋白溶液

10、装入（的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量的物质的量浓度为浓度为20mmol/L的（的（）中，）中，pH为（为（），透析），透析12小时，目的是小时，目的是（）或用）或用于更换样品中的（于更换样品中的（）。透析袋一）。透析袋一般用般用硝酸纤维素硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0缓冲液缓冲液(4)透析透析12.凝胶色谱制作凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃厘米的玻璃管，两端需用

11、砂纸磨平。管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网，再用，再用100100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。a a、选择合适的的橡皮塞，、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；中间打孔；b b、在橡皮塞顶部切出锅底状的、在橡皮塞顶部切出锅底状的（），在），在0.5ml0.5ml的（的（）头部）头部切下（切下（）长的一段，插入橡皮塞孔内，）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cm底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮

12、塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。注意注意c.c.剪尼龙网小圆片覆盖在（剪尼龙网小圆片覆盖在（）上，用（上，用（）的尼龙纱将橡皮塞）的尼龙纱将橡皮塞（）包好，插到玻璃管一端。）包好，插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做（、色谱柱下端用移液头部做（），），连接一细的（连接一细的（），并用螺旋夹），并用螺旋夹控制尼龙管的（控制尼龙管的（），另一端放），另一端放入收集（入收集（）的收集器内）的收集器内橡皮塞的凹面橡皮塞的凹面100100目目上部上部出口部位出口部位尼龙管尼龙管打开与关闭

13、打开与关闭色谱流出液色谱流出液安装其他附属结构。安装其他附属结构。顶塞的制作：顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞插入安装了玻璃管的橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体个整体。2）凝胶色谱柱填料的处理）凝胶色谱柱填料的处理（1 1）凝胶的选择：）凝胶的选择：（）（）（G-75G-75）“G”G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水膨胀时吸水7.57.5克。克。（2 2）方法：）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量配置凝胶悬浮液：

14、计算并称取一定量的凝胶浸泡于（的凝胶浸泡于（）中充分溶胀后，）中充分溶胀后，配成（配成（）。）。蒸馏水蒸馏水凝胶悬浮液凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶固定：将色谱柱处置固定在支架上固定：将色谱柱处置固定在支架上装填：装填：将（将（）一次性的缓慢一次性的缓慢倒入（倒入（）内，装填时轻轻敲动色）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液凝胶悬浮液色谱柱色谱柱注意：注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：泡存在

15、：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。的洗脱次序，降低分离效果。洗涤平衡洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()()高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l的的磷酸缓冲磷酸缓冲液（液（pHpH为为7.07.0）充分（）充分（）1212小时。小时。洗涤平衡洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱

16、液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。新填装。50cm50cm3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱加样前加样前 打开下端出口，使柱内凝打开下端出口，使柱内凝胶面上的（胶面上的（）缓）缓慢下降到与（慢下降到与（）平齐，关闭出口平齐，关闭出口缓冲液缓冲液凝胶面凝胶面加加透析透析样样品品调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用（滴加透析样品：用（）将）将1ml（）的样品加到色谱柱的（的样品加到色谱柱的（）样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：（）洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱收集：收集：待（待（）接近色

17、谱柱底接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（端时，用试管收集流出液，每（）收集一试管连续收集收集一试管连续收集注意正确的加样操作：注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面 贴壁加样贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动使吸管管口沿管壁环绕移动吸管吸管透析液透析液顶端顶端样品完全进凝胶层样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质红色的蛋白质血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。离过程非常直观

18、，大大简化了实验操作。思考思考血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电

19、泳进行（行（）。）。思考思考样品的粗分离样品的粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（判断（）的蛋白质是否达到要求，）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。需要进行蛋白质的鉴定。纯化纯化3.SDS3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红鉴定血红蛋白纯度蛋白纯度（1 1）试剂的配制）试剂的配制丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 用去离用去离子水配制子水配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙烯酰，下同）的丙烯酰胺和胺和1%1%的的N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液甲叉

20、双丙烯酰胺的贮存液十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）用去离子水配成用去离子水配成10%10%的贮存液，于室温保存。的贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的TrisTris缓冲液缓冲液 TEMED TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制用去离子水配制10%10%过硫酸铵：作用提供驱过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。基。此溶液须配制新鲜液。TrisTris

21、甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 25 mmol/L Tris 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样品处理液样品处理液 50 mmol/L TrisHCl(pH 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)6.8)，100 mmol/L DTT(100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。染色液染色液 0.1%0.1%的考马斯亮蓝的

22、考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲的甲醇，醇，10%10%的冰醋酸的冰醋酸脱色液脱色液 10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要命。因此在进行电泳操作时

23、一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。SDS-SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺分离胶制备分离胶制备1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2 2）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶制备制备用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺2.7 mL2.7 mL，1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8的的TrisTris缓冲液缓冲液2.5 mL2.5 mL，10%10%的的SDS 0.1 mLSDS 0.1 mL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 mL0.1 mL，T

24、EMED TEMED 0.006mL0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子梳子的齿长再加的齿长再加0.5 cm)0.5 cm)，再在胶液面上小心注入，再在胶液面上小心注入一层水（约高一层水（约高23 mm23 mm），以阻止氧气进入凝），以阻止氧气进入凝胶溶液。胶溶液。（2 2）电泳方法步骤）电泳方法步骤配制配制SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水用去离子水2.7 mL2.7 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺0.67 mL0.67

25、 mL，1.0 mol1.0 mol、pH 6.8pH 6.8的的TrisTris缓冲液缓冲液0.5 mL0.5 mL，10%10%的的SDS0.041 mLSDS0.041 mL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.04 mL0.04 mL，TEMED TEMED 0.004 mL0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间

26、的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。将凝胶垂直放置于室温下聚合。分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约30 min30 min），倾出覆），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。盖水层，再用滤纸吸净残留水。3 3）样品处理）样品处理5)5)加样加样在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，体积比加入样品处理液，在在100 100 温度下加热温度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性。，以使蛋白质变性。按顺序加样，加样量通常为按顺序加样，加样量通常为1025 L1025 L。样。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色

27、谱分离之前即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分的样品和凝胶色谱分离之后的样品离之后的样品4 4）浓缩胶聚合完全后（）浓缩胶聚合完全后（30 min30 min），小心移出梳），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入TrisTris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。部两玻璃板之间的气泡。7 7）剥胶）剥胶 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位

28、。部切去一角，以标注凝胶的方位。8 8）染色）染色 将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色色1-2 h1-2 h。6)6)电泳电泳 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 8 V/cmV/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约底部上方约1 cm1 cm处，关闭电源。处，关闭电源。10)10)观察结果：观察结果：9)9)脱色：脱色：染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱

29、色换脱色液脱色3-10 h3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景，其间需多次更换脱色液至背景清楚。清楚。观察你处理的血液样品离心后是否分层观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18），如果分层不明显，），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。蛋白的提取纯度。三三 实验结果分析与评价实验结果分析与评价

30、由于凝胶是一种半透明的介质，因此可由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，观察色或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱体以消除气泡

31、，消除不了时要重新装柱。柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。讨论：如何测定蛋白质的分子量？讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，质的分子量时，可选用一组已知分子量的可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，率和分子量的对数作标准曲线，可以测定可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售售51 结束语结束语