基因重组和基因工程课件.ppt
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- 基因 重组 基因工程 课件
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1、目录目录 Genetic Recombination and Genetic Engineering目录目录第一节第一节自然界自然界DNADNA重组和基因转移是重组和基因转移是经常发生的经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer DNA Recombination and Gene Transfer Occur FrequentlyOccur Frequently in Naturein Nature目录目录DNADNA重组重组接合作用接合作用(conjugation)转化作用转化作用(transformation)转导作用转导作用(transducti
2、on)转转 座座(transposition)同源重组同源重组(homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)目录目录 发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组(homologous recombination)(homologous recombination),又称又称基本基本重组(重组(general recombinationgeneral recombination)。是最基。是最基本的本的DNADNA重组方式,通过链的断裂和再连接,重组方式,通过链的断裂和再连接,在
3、两个在两个DNADNA分子同源序列间进行单链或双链分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。片段的交换。以以E.coliE.coli的同源重组为例,了解同源重组的同源重组为例,了解同源重组机制的机制的HollidayHolliday模型。模型。一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNADNA重组方式重组方式目录目录nHollidayHolliday模型的模型的4 4个关键步骤:个关键步骤:两个同源染色体两个同源染色体DNADNA排列整齐;排列整齐;片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant)一个一个DNADNA的一
4、条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNADNA对对应的链连接,形成应的链连接,形成HollidayHolliday中间体;中间体;通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNADNA;HollidayHolliday中间体切开并修复,形成两个双中间体切开并修复,形成两个双链重组体链重组体DNADNA,分别为:,分别为:目录目录 片段重组体片段重组体 (见模型图左边产物):(见模型图左边产物):切开的链与原来断裂的是同一条链,重组切开的链与原来断裂的是同一条链,重组 体含有一段异源双链区,其两侧来自同一亲体含有一段异源双链区,其两侧来自同一亲本本DNADNA。拼接重组体拼接重组
5、体(见模型图右边产物):(见模型图右边产物):切开的链并非原来断裂的链,重组体异切开的链并非原来断裂的链,重组体异源双链区的两侧来自不同亲本源双链区的两侧来自不同亲本DNADNA。目录目录 内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA)内切酶内切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 HolidayHoliday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 目录目录Holiday中间体中间体5
6、3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体目录目录二、细菌的基因转移与重组有四种方式二、细菌的基因转移与重组有四种方式(一)接合作用(一)接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时,质粒接触时,质粒DNADNA从一个细胞(细菌)转从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)的移至另一细胞(细
7、菌)的DNADNA转移称为转移称为接接合作用合作用(conjugation)(conjugation)。目录目录 可接合质粒如可接合质粒如 F F 因子因子(F factor)(F factor)细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNADNA分子。分子。质粒质粒目录目录(二)转化作用(二)转化作用通过自动获取或人为地供给外通过自动获取或人为地供给外源源DNADNA,使细胞或培养的受体细胞获,使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型,称为得新的遗传表型,称为转化作用转化作用 (transformation)(transformation)。目录目录例:例:溶菌时,裂解的溶菌时,裂
8、解的DNADNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。目录目录(三)转导作用(三)转导作用当病毒从被感染的(供体)细胞释放当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(供体)细胞时,发出来、再次感染另一(供体)细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的生在供体细胞与受体细胞之间的DNADNA转移及转移及基因重组即为基因重组即为转导作用转导作用(transduction)(transduction)。目录目录噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径 (lysis pathway)(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径 (lysogenic(lysogenic
9、pathway)pathway)目录目录三、位点特异重组,即特异位点间三、位点特异重组,即特异位点间发生的整合发生的整合 位点特异重组位点特异重组(site-specific(site-specific recombination)recombination)是由整合酶催化,在两是由整合酶催化,在两个个DNADNA序列的特异位点间发生的整合。序列的特异位点间发生的整合。目录目录噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合;反染色体的特异靶位点发生选择性整合;反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒录病毒cD
10、NAcDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long(long terminal repeat,LTR)terminal repeat,LTR)。(一)(一)噬菌体噬菌体DNADNA的整合的整合目录目录(二)细菌的特异位点重组(二)细菌的特异位点重组沙门菌沙门菌H H片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。目录目录hixhix为反向重复序列,它们之间的为反向重复序列,它们之间的H H片段片段可在可在HinHin控制下进行特异位点重组控制下进行特异位点重组(倒位倒位)。H H片段上有两个启动子片段上有两个启动子P P,其一驱动,其一驱动hinhin基基因表达,另一正向时驱动因表达,另一
11、正向时驱动H2H2和和rH1rH1基因表基因表达,反向达,反向(倒位倒位)时时H2H2和和rH1rH1不表达。不表达。rH1rH1为为H1H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。目录目录 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶转位片段转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门菌沙门菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变目录目录(三)免疫球蛋白基因的重排(三)免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)(Ig),由两条轻链,由两条轻链(L(L链链)和两条重和两条重链链(H(H链链)组成,分别由三个独立的基因族
12、编码,组成,分别由三个独立的基因族编码,其中两个编码轻链其中两个编码轻链(和和),一个编码重链。,一个编码重链。轻链的基因片段:轻链的基因片段:重链的基因片段:重链的基因片段:L V J C L V D J C 目录目录 重链重链(IgH)(IgH)基因的基因的V-D-JV-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)(IgL)基基因的因的V-JV-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在特异位点上。在V V片片段的下游,段的下游,J J片段的上游以及片段的上游以及D D片段的两侧片段的两侧均 存 在 保 守 的 重 组 信 号 序 列均 存 在 保 守 的 重 组 信 号 序 列(recombina
13、tion signal sequence,RSS)(recombination signal sequence,RSS)。此重排的重组酶基因此重排的重组酶基因rag(recombination rag(recombination activating gene)activating gene)共有两个,分别产生蛋共有两个,分别产生蛋白质白质RAG1RAG1和和RAG2RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段目录目录V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHV VJ J单链切开单链切开RAG1
14、RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程目录目录四、转座重组四、转座重组 由插入序列和转座子介导的基因移位或由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为重排称为转座转座(transposition)(transposition)。大多数基因在基因组内的位置是固定的,大多数基因在基因组内的位置是固定的,但有些基因可以从一个位置移动到另一但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的位置。这些可移动的DNADNA序列包括插入序序列包括插入序列和转座子。列和转座子。目录目录 插入序列插入序列(inse
15、rtion sequences,IS)(insertion sequences,IS)组成:组成:IRTransposase GeneIR(一)插入序列转座(一)插入序列转座 二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats,IR)(inverted repeats,IR)序列序列 特有的正向重复序列特有的正向重复序列 一个转座酶(一个转座酶(transposase)transposase)编码基因编码基因目录目录插入序列发生转座的形式:插入序列发生转座的形式:保守性转座保守性转座(conservative transposition)(conservative tran
16、sposition)复制性转座复制性转座(duplicative transposition)(duplicative transposition)目录目录插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座目录目录 转座子转座子(transposons)(transposons)可从一个染色可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。体位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因(二)转座子转座(二)转座子转座 转座子组成:转座子组成:反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因目录目录 细菌的可流动性
17、元件细菌的可流动性元件A A插入序列:转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列:转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)B B转座子转座子Tn3Tn3:含有转座酶、:含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C C转座子转座子Tn10Tn10:含四环素抗性基因及两个相同的插入序列:含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10LIS10L目录目录由转座子介导的转座由转座子介导的转座目录目录第二节第二节 重组重组DNADNA技术技术又称又称DNADNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also
18、 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone Called DNA Cloning or Molecular Clone 目录目录重组重组DNADNA技术的发展史技术的发展史18651865年年 G.J.MendelG.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。19441944年年 O.T.AveryO.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。19731973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNADNA分子。分子。197719
19、77年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司,专门应用重组传工程公司,专门应用重组DNADNA技术制造医学上重要技术制造医学上重要的药物。的药物。19801980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNADNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。19971997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。目录目录相关概念相关概念n DNADNA克隆克隆n 工具酶工具酶n 目的基因目的基因n 基因载体基因载体基本原理基本原理 重组重组DNADNA技术与医学的关系技术与医学的关系本节主要
20、内容:本节主要内容:目录目录一、重组一、重组DNADNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone):(clone):来自同一始祖的相同副本或来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)(cloning),即无性繁殖。即无性繁殖。(一)(一)DNADNA克隆克隆目录目录 技术水平:技术水平:分子克隆分子克隆(molecular clone)(molecular clone)(即(即DNA DNA 克隆)克隆)细胞克隆细胞克隆 个体克隆(动物或植物)个体克隆(动物或植物)目录目录应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗
21、应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的天然的或人工的DNADNA)与载体)与载体DNADNA接合成一具有接合成一具有自我复制能力的自我复制能力的DNADNA分子分子复制子复制子(replicon)(replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一量同一DNADNA分子,也称分子,也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA DNA(recombinant DNA)(reco
22、mbinant DNA)。DNADNA克隆克隆目录目录 生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细胞工程等 目的:目的:分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA DNA 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)基因工程基因工程(genetic engineering)(genetic engineering)实实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,又称重组工程,又称重组DNADNA工艺学。工艺学。目录目录(二)工具酶(二)工具酶 限制性核酸内切酶限
23、制性核酸内切酶 DNADNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶目录目录重组重组DNADNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列,切割识别特异序列,切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键,使二酯键,使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片
24、段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段,具有完整大片段,具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性,而无外切活性,而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成,双链第二链合成,双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补,标记或进行填补,标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化,或标记探针羟基末端磷酸化,或标记探针末
25、端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目录目录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction restriction endonuclease)endonuclease)限 制 性 核 酸 内 切 酶限 制 性 核 酸 内 切 酶(r e s t r i c t i o n(r e s t r i c t i o n endonuclease,RE)endonuclease,RE)是识别是识别DNADNA的特异序列的特异序列,并并在识别位点或其周围切割双链在识别位点或其周围切割双链DNADNA的一
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