基因组测序基本原理分解课件.ppt
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- 基因组 基本原理 分解 课件
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1、基因组测序基因组测序生物信息系列讲座之二大纲I.核酸DNA的发现以及测序历史简介II.双脱氧化(Sanger dideoxy method)测序III.大片段的DNA测序与基因组测序的大发展VI.人类基因组V.1000美元个体化基因组测序计划(The“$1,000 dollar genome)On WebCT-“The$1000 genome”-review of new sequencing techniques by George ChurchPart I.核酸测序原理核酸发现与测序简史MC chapter 12DNA测序的简史DNA测序的方法A.双脱氧法(Sanger dideoxy)(
2、primer extension/chain-termination)method:最流行也是最广为接受的方法。B.Maxam-Gilbert化学剪切法(chemical cleavage method):DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner.This method is not easily scaled and is rather tediousC.焦磷酸测序(Pyrosequencing):measuring chain extension by pyrophosphate m
3、onitoring。焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳,DNA片段也无须荧光标记,操作极为简便,可以快速、准确地确定DNA序列。Single stranded DNA5353Sanger 双脱氧测序原理a)常规的PCR,粘附(Anneal)Sanger 双脱氧测序原理b)在延伸的时候将DNA聚合酶与加入正常的dNTP,同时掺入少量的双脱氧的ddNTP53DNA聚合酶延伸方向Sanger 双脱氧测序原理5353TTTTddAddAddAddA以ddATP为例,可以看到在反应中带有T的模板被掺入的互补的ddATP随机停止。因为ddATP不能够再使其主链延伸。如何读取这些D
4、NA片段?同位素标记同位素标记的引物(如 32P)同位素标记的dNTPs(如35S 或者 32P)荧光标记化学合成时带有荧光素标记的ddNTPs被掺入到反应中。每一种ddNTP都带有自身特定的荧光波长以便于观测测序结果分析目前一般采用凝胶电泳法分析-能够比较好的将每一条dNTP产生的DNA条带分离开。DNA测序胶:老方法利用电泳或者放射自显影的方法来分析DNA序列在反应中加入不同的ddNTP得到结果带有同位素标记的引物或者ddNTP被掺入到反应中,以便于观测自动测序仪输出DNA测序的实例样本 一个带有28个DNA样品的胶图:绿带:碱基A,,蓝带 C,黄带G,红带 T.越小的片段跑得越快自动测序
5、仪http:/www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/publicat/hgn/v10n3/images/megabaces.jpg测序的趋势相对而言一般很少实验室会自己做测序,一则自身测序费用比较高,而且荧光试剂容易粹灭,同时也比较消耗时间,另外可能出现一些其它问题引起结果不成功。所以大部分的测序都是送到相关的测序中心或者公司完成:-下面这个序列就是一个自动测序仪记录的一段DNA片段Part II.大片段DNA测序与基因组测序的大发展19蜜蜂基因组是如何获得的?基因组文库的建立 目前基将基因组片段打碎建立文库。基因组文库含有某种生物体全部基因的
6、随机片段的重组DNA克隆群体。Page 22酵母人工染色体酵母人工染色体(YACs)200-1000 kbBacteriophage P1 90 kbCosmids 40 kbBacteriophage l l 9-23 kb质粒(2-6 kb)Page 23大片段载体大片段载体Lambda phage 插入大小:2030 kbCosmids 插入大小:3545 kbBACs and PACs(bacterial and P1 artificial chromosomes(Viral)respectively)插入大小:100300 kbYACs(yeast artificial chromo
7、somes)插入大小:2001,000 kbPage 24大片段插入载体大片段插入载体 Lambda 噬菌体 以及 cosmids 插入稳定 但插入片段的容量可能不足以做大规模的测序 YACs 能够插入大片段 但不太稳定,比较难实际操作Page 25BACs and PACs BACs and PACs 大规模测序通用质粒 对插入片段大小比较合适,而且容易使用 与其它正常质粒一样能够扩增和分离全基因组鸟枪法测序 但是片段比较大时,如在基因组测序时,仅仅由Sanger方法并不合适,因此Shotgun测序,将基因大片段打碎后测序。鸟枪法战略(Shotgun Strategy)又称随机测序战略,是由
8、美国塞莱拉遗传公司创始人克雷格文特尔发明,主要针对大片段的全长测序。因为整个基因组太长而每次只能测得一个500的小片断(read)。鸟枪法测序步骤 第一,建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量,即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组5倍以上。第二,高效、大规模的末端测序。第三,序列集合。第四,填补缺口。鸟枪法测序简要SIZE SELECTSHEAR鸟枪法测序技术LIGATE&CLONESEQUENCE550bpPage 30重叠群重叠群Contigs 重叠群是指一组相互重叠的染色体DNA序列 如何建立重叠群基因克隆?For sequencing one
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