第三紫外可见分光光度法优质课件.ppt

1、第三紫外可见分光光度法优选第三紫外可见分光光度法1.11.1光学分析基础光学分析基础一一 电磁辐射的性质电磁辐射的性质 1 1、光学分析法根据物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物、光学分析法根据物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用建立起来的一类分析方法。质相互作用建立起来的一类分析方法。2 2、电磁辐射、电磁辐射:以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量传播媒介的一种能量(交变电场和磁场交变电场和磁场)。3 3、波动性和粒子性、波动性和粒子性 (1)(1)波动性波动性:电磁辐射为电磁辐射为正弦波（波长、频率、正弦波（波长、频率、速度、振幅

2、）。与其它速度、振幅）。与其它波，如声波不同，电磁波，如声波不同，电磁波不需传播介质，可在波不需传播介质，可在真空中传输真空中传输 。频率：为空间某点的电场每秒钟达到正极大频率：为空间某点的电场每秒钟达到正极大值的次数（单位时间电磁场振动次数）。值的次数（单位时间电磁场振动次数）。周期：两个相邻矢量极大（或极小）通过空周期：两个相邻矢量极大（或极小）通过空间某固定点所需的时间间隔叫做辐射的周期。间某固定点所需的时间间隔叫做辐射的周期。波长：相邻两个波峰或波谷间的距离。波长：相邻两个波峰或波谷间的距离。波数：是波数：是1cm1cm内波的数目内波的数目=1/=1/。普朗克方程普朗克方程：E E=h

3、v hv，式中的式中的h h叫普朗克常量叫普朗克常量(Planck constantPlanck constant),),其值为其值为6.6266.6261010-34-34 J Js s。普朗克认为普朗克认为,物体只能按物体只能按h h的整数倍一份一份地吸收或释出的整数倍一份一份地吸收或释出光能光能,而不可能是而不可能是0.50.5h h等任何非等任何非整数倍。即所谓的能量量子化概整数倍。即所谓的能量量子化概念，但它只涉及光作用于物体时念，但它只涉及光作用于物体时能量的传递过程。能量的传递过程。2 2 能态能态 (1)(1)量子理论量子理论:物质粒子总是处于特定的不连物质粒子总是处于特定的不

4、连续的能量状态，即能量是量子化的。续的能量状态，即能量是量子化的。(2)(2)当粒子的状态发生变化时，该粒子将吸当粒子的状态发生变化时，该粒子将吸收或发射完全等于两个能级之间的能量差；收或发射完全等于两个能级之间的能量差；反之亦是成立的，即反之亦是成立的，即 二二 电磁波谱电磁波谱2在同一波长下，各组分吸光度具有加和性2 溶液酸度配位数和水解等与 pH 有关适用于分析多组分混合物，混浊试样（生物组织液）根据吸收谱带波长和电子跃迁类型推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）。不饱和基团（CC，C O）浓度过高会使C与A关系偏离定律。吸收峰max不同的有机化合物具有不同的吸收光谱。（2）不饱和烃及

5、共轭烯烃反式空间位阻小，双键与苯环在同一平面上，容易产生共轭。2 有机化合物的构型，构象测定频率：为空间某点的电场每秒钟达到正极大值的次数（单位时间电磁场振动次数）。1两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）(2)当粒子的状态发生变化时，该粒子将吸收或发射完全等于两个能级之间的能量差；一 仪器测量条件的选择含杂原子不饱和基团（C N，C O）不用拉动吸收池(同时通过参比溶液和待测溶液），可以减小移动误差特点强度大，摩尔吸收系数大，通常在1042104L mol1cm1，吸收峰的位置一般在217280nm；白光为一白光为一复合光复合光三三 物质的颜色物质的颜色能复合成白光的两种颜能复合成白光的两种颜色的

6、光叫互补色光。物色的光叫互补色光。物质所显示的颜色是吸收质所显示的颜色是吸收光的互补色，即透过光光的互补色，即透过光颜色颜色 物质颜色和吸收光的关系物质颜色和吸收光的关系物质颜色物质颜色吸收光吸收光颜色颜色波长波长/nm/nm黄绿黄绿紫紫400450黄黄蓝蓝450480橙橙绿蓝绿蓝480490红红蓝绿蓝绿490500红紫红紫绿绿500560紫紫黄绿黄绿560580蓝蓝黄黄580610绿蓝绿蓝橙橙610650蓝绿蓝绿红红6507801.2 1.2 紫外可见吸收光谱的产生紫外可见吸收光谱的产生1 1 原理原理 运动的分子外运动的分子外层电子吸收紫外可层电子吸收紫外可见光区的辐射见光区的辐射 产产生

7、电子能级跃迁生电子能级跃迁 紫外可见吸收光谱。紫外可见吸收光谱。能级组成除了电子能级外，分子吸收能量将伴随能级组成除了电子能级外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动能级和着分子的振动和转动，即同时将发生振动能级和转动能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振转转动能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。因此，跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化分子的能量变化E E为各种形式能量变化的总和为各种形式能量变化的总和 其中其中EeEe最大：最大：1-20eV;1-20eV;EvEv次之：次之：0.05-1eV;0.05-1eV;

8、ErEr最小：最小：0.05eV 0.05eV 2 2分子吸收光谱跃迁类型分子吸收光谱跃迁类型 K带：max=240nm，=13000依据Lamber-Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线。物质颜色和吸收光的关系=1c1b+2c2b+3c3b+ncnb浓度过高会使C与A关系偏离定律。由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（*）带。溶剂参比试样组成简单、共存组份少(基体干扰少)、显色剂不吸收时，直接采用溶剂(多为蒸馏水)为参比；随着溶剂极性的增大,分子振动受到限制,精细结构就会逐渐消失,合并为一条宽而低的吸收带。第二节 紫外可见分光光度计浓度过高会使C与

9、A关系偏离定律。例精密称取B12样品25.Fe(C7H4O3)3+单光束分光光度计原理图醛酮中均含有羰基，含有n，和电子，可产生n*，*和n*三个吸收带，n*又称为R带，落于近紫外或紫外光区，吸收带出现在270300nm，强度低，吸收系数为1020，并且谱带略宽。E=A/(bc)消除方法：选择较窄的入射狭缝宽度和提高单色器分辨率决定双波长分光光度计原理图例1 某有色溶液，用1cm比色皿时其透射比为T，如改用2cm比色皿时其透射比为多少？B带是由苯环本身振动及闭合环状共轭双键*跃迁而产生的吸收带，是芳香族（包括杂环芳香族）的主要特征吸收带。参比溶液目的消除溶液中其它成分（溶剂，试剂，样品基体）以

10、及吸收池对光的反射和吸收所带来的误差1.1.*跃迁跃迁 饱和烃（乙烷饱和烃（乙烷:max=135nm:max=135nm）E E很高，很高，150nm105 强带强带;min103 弱带弱带4 4 有机化合物的紫外可见吸收光谱有机化合物的紫外可见吸收光谱（1）饱和烃及取代烃）饱和烃及取代烃 饱和单键碳氢化合物含有饱和单键碳氢化合物含有CH和和CC键，只含有键，只含有键电子键电子,一般在远紫外区才有吸收，又称为真空紫外区，因一般在远紫外区才有吸收，又称为真空紫外区，因为小于为小于160nm的紫外光要被空气中的氧所吸收，因此的紫外光要被空气中的氧所吸收，因此需要在无氧或真空中进行测定，应用不多；这

11、类化需要在无氧或真空中进行测定，应用不多；这类化合物在合物在2001000nm范围内无吸收带，在紫外吸收光范围内无吸收带，在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等。谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等。当饱和单键碳氢化合物中的氢被氧，氮，卤素，硫等当饱和单键碳氢化合物中的氢被氧，氮，卤素，硫等杂原子取代时，即其取代物如卤代烃，醇，胺等，杂原子取代时，即其取代物如卤代烃，醇，胺等，由于这类原子中有由于这类原子中有n电子，可产生电子，可产生n*，从而产生，从而产生红移。红移。（2）不饱和烃及共轭烯烃）不饱和烃及共轭烯烃 这类化合物含有孤立双键和共轭双键，都含有这类化合物含有孤立双键和共

12、轭双键，都含有电子，吸收能量后可产生电子，吸收能量后可产生*跃迁跃迁。由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（*）带。）带。特点强度大，摩尔吸收系数大，通常在特点强度大，摩尔吸收系数大，通常在1042104L mol1cm1，吸收峰的位置一般在，吸收峰的位置一般在217280nm；K带的波长和强度与共轭体系的带的波长和强度与共轭体系的数目，位置和取代基的种类有关。数目，位置和取代基的种类有关。丁二烯丁二烯max=217nm max 104 max=217nm max 104 巴豆醛巴豆醛

13、max=217.5nm max:1.5max=217.5nm max:1.5104 104 芳香环上如有生色团取代时，也会出现芳香环上如有生色团取代时，也会出现K K带，带，如苯乙烯如苯乙烯max248nm max 1.4max248nm max 1.4104104 苯甲醛苯甲醛max=249nm max max=249nm max 1.11.1104104（3 3）羰基化合物（醛酮）羰基化合物（醛酮）醛酮中均含有羰基，含有醛酮中均含有羰基，含有n n，和和电子，可电子，可产生产生n n*，*和和n n*三个吸收带，三个吸收带，n n*又称为又称为R R带，落于近紫外或紫外光区，带，落于近紫外

14、或紫外光区，吸收带出现在吸收带出现在270270300nm300nm，强度低，吸收系，强度低，吸收系数为数为10102020，并且谱带略宽。，并且谱带略宽。醛酮的羰基与双键共轭时，形成不饱和醛酮醛酮的羰基与双键共轭时，形成不饱和醛酮类化合物，发生红移，强度增强。类化合物，发生红移，强度增强。（4 4）苯及其取代物）苯及其取代物苯有三个吸收带，它们都由苯有三个吸收带，它们都由*跃迁引起的跃迁引起的B B带是由苯环本身振动及闭合环状共轭双键带是由苯环本身振动及闭合环状共轭双键*跃迁而产跃迁而产生的吸收带，是芳香族（包括杂环芳香族）的主要特征生的吸收带，是芳香族（包括杂环芳香族）的主要特征吸收带。其

15、特点是在吸收带。其特点是在230230270nm270nm呈现一宽峰，且具有呈现一宽峰，且具有精细结构，精细结构，max=255nmmax=255nm，maxmax约约200200，属弱吸收，属弱吸收,常用来识别芳香族化合物。常用来识别芳香族化合物。B B带在气态或非极性溶剂中，带在气态或非极性溶剂中，有许多的精细结构，是由于振动跃迁在基态电子跃迁上有许多的精细结构，是由于振动跃迁在基态电子跃迁上的叠加，在极性溶剂中，溶质与溶剂分子的相互作用使的叠加，在极性溶剂中，溶质与溶剂分子的相互作用使这种精细结构消失。这种精细结构消失。4 紫外可见吸收光谱的应用含杂原子不饱和基团（C N，C O）2 检

16、测器类型光电池、光电管和光电倍增管。Fe(C7H4O3)3+1吸光系数的物理意义单位浓度、单位厚度的吸光度2、电磁辐射:以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量(交变电场和磁场)。含杂原子不饱和基团（C N，C O）下表列出紫外、可见吸收光谱中常用的溶剂，以供选择时参考。二、紫外可见分光光度计的类型1 显色剂用量配位数与显色剂用量有关；这类化合物在2001000nm范围内无吸收带，在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等。1 单色器能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置浓度过高会使C与A关系偏离定律。溶质浓度改变可能会引起其离解，缔合，光化学反应，互变异构，络合物配位

17、数变化等作用，使被测组分的吸收曲线发生变化。使用时来回拉动吸收池（轮流通过参比溶液和样品溶液）移动误差在形成逐级配合物，其用量更要严格控制（二）单波长双光束分光光度计普朗克认为,物体只能按h的整数倍一份一份地吸收或释出光能,而不可能是0.（一）显色反应和显色剂05-1eV;Er最小：0.（二）单波长双光束分光光度计E E吸收带吸收带 E E带也是芳香族化合物的特征吸收谱带，可以带也是芳香族化合物的特征吸收谱带，可以认为是苯环内三个乙烯基共轭发生的认为是苯环内三个乙烯基共轭发生的-*跃迁所发生的。跃迁所发生的。E E带可分为带可分为E E1 1和和E E2 2二个吸收带。二个吸收带。E E1 1

18、带的吸收峰大约在带的吸收峰大约在180nm180nm（10104 4）；）；E E2 2带约在带约在200nm200nm（7000210210甘油甘油 230 230乙醇乙醇 210 210氯仿氯仿 245 245甲醇甲醇 210 210四氯化碳四氯化碳 265 265异丙醇异丙醇 210 210乙酸甲酯乙酸甲酯 260 260正丁醇正丁醇 210 210乙酸乙酯乙酸乙酯 260 26096%96%硫酸硫酸 210 210乙酸正丁酯乙酸正丁酯 260 260乙醚乙醚 220 220苯苯 280 280二氧六环二氧六环 230 230甲苯甲苯 285 285二氯甲烷二氯甲烷 235 235吡啶吡

19、啶 303 303己烷己烷 200 200丙酮丙酮 330 330环己烷环己烷 200 200二硫化碳二硫化碳 375 3752 2 共轭体系的存在共轭体系的存在 红移红移 CH2=CH2 CH2=CH2 的的*跃迁，跃迁，max 165200nm max 165200nm；而而 1,3 1,3 丁二烯，丁二烯，max=217nm max=217nm 由于由于键与键与键相互作用，产生键相互作用，产生共轭效应，生共轭效应，生成大成大键，使键，使*轨道的能量降低，轨道的能量降低，*跃迁所需跃迁所需的能量也减小，所以生色团的吸收谱带移向长波区和的能量也减小，所以生色团的吸收谱带移向长波区和吸收强度增

20、加吸收强度增加.CH2CH2 185CHCH2CH CH2 217CHCH2CHCHCH CH2258CHCH2CHCH()2296共轭双键数增加，红移增大共轭双键数增加，红移增大1.4 1.4 紫外可见吸收光谱的应用紫外可见吸收光谱的应用1 1 定性分析定性分析 不同的有机化合物具有不同的吸收光谱。根据化合物不同的有机化合物具有不同的吸收光谱。根据化合物的特征吸收峰波长和强度可以进行物质的鉴定，的特征吸收峰波长和强度可以进行物质的鉴定，结合红结合红外光谱，质谱和核磁共振谱进行定性鉴定和结构分析外光谱，质谱和核磁共振谱进行定性鉴定和结构分析波长波长吸收带吸收带结构结构200200400nm40

21、0nm无无饱和直链烃，脂环烃，饱和脂肪烃饱和直链烃，脂环烃，饱和脂肪烃270270350 nm350 nm弱弱简单的非共轭发色团简单的非共轭发色团210210250 nm250 nm强强共轭双键共轭双键250250300 nm300 nm中等强度中等强度苯环苯环2 2 有机化合物的构型，构象测定有机化合物的构型，构象测定（1 1）顺反异构）顺反异构 一般，反式异构体的一般，反式异构体的maxmax和和maxmax比相应的比相应的顺式异构体大。顺式异构体大。在顺式肉桂酸和反式肉桂酸中，顺式空间在顺式肉桂酸和反式肉桂酸中，顺式空间位阻大，苯环与侧链双键共平面性差，不易产位阻大，苯环与侧链双键共平面

22、性差，不易产生共轭；反式空间位阻小，双键与苯环在同一生共轭；反式空间位阻小，双键与苯环在同一平面上，容易产生共轭。因此，反式的最大吸平面上，容易产生共轭。因此，反式的最大吸收波长收波长maxmax=295 nm=295 nm，而顺式的最大吸收波，而顺式的最大吸收波长长maxmax=280 nm=280 nm。根据紫外吸收光谱的max判断是否存在互变异构体参比溶液目的消除溶液中其它成分（溶剂，试剂，样品基体）以及吸收池对光的反射和吸收所带来的误差消除办法提高仪器自身的性能。依据Lamber-Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线。不同波长光对样品的作用不同，吸收强度不同,以A作图所得的曲线。

23、透过光的强度(t)和入射光强度(o)之比称为透光度（T)T=t/o(2)对吸收光谱精细结构影响若不被吸收，吸光度小于真实值，出现负偏差。运动的分子外层电子吸收紫外可见光区的辐射 产生电子能级跃迁 紫外可见吸收光谱。即所谓的能量量子化概念，但它只涉及光作用于物体时能量的传递过程。=1c1b+2c2b+3c3b+ncnb注当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强。优选第三紫外可见分光光度法例精密称取B12样品25.2 共轭体系的存在 红移光学元件污染（灰尘散射，光学部件反射，散射）。吸收峰maxA=A1+A2+A3

24、+An（2 2）互变异构体）互变异构体 根据紫外吸收光谱的根据紫外吸收光谱的maxmax判断是否存在判断是否存在互变异构体互变异构体酮式没有共轭双键，它在酮式没有共轭双键，它在204nm204nm处仅有弱吸收；处仅有弱吸收；而烯醇式由于有共轭双键，因此在而烯醇式由于有共轭双键，因此在245nm245nm处有处有强的强的K K吸收带（吸收带（=18000L=18000Lmolmol-1-1cmcm-1-1)3 3 定量分析定量分析 根据朗伯比尔定律，物质在一定波根据朗伯比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成正比，因此，长处的吸光度与它的浓度成正比，因此，选择合适的波长，测定溶液的吸光度就

25、选择合适的波长，测定溶液的吸光度就可求出溶液的浓度和物质的量。可求出溶液的浓度和物质的量。第二节第二节 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计图图3.6 3.6 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计1 1：光源；：光源；2 2：单色器；：单色器；3 3吸收池；吸收池；4 4检测系统；检测系统；5 5显示系显示系统统一一 主要部件与性能主要部件与性能（一）（一）光源光源 白炽光源钨灯或卤钨灯可见光源白炽光源钨灯或卤钨灯可见光源 350 3501000nm1000nm 气体放电光源氢灯或氘灯紫外光源气体放电光源氢灯或氘灯紫外光源 200 200360 360 nm nm 基本要求基本要求所需的光谱

26、区域内能够发射连续辐射所需的光谱区域内能够发射连续辐射足够的辐射强度足够的辐射强度良好的稳定性良好的稳定性辐射能量随波长的变化应尽可能小辐射能量随波长的变化应尽可能小（二）单色器1 1 单色器能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置单色器能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置2 2 组成狭缝、色散元件（棱镜，光栅）组成狭缝、色散元件（棱镜，光栅）3 3 棱镜色散原理依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折棱镜色散原理依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。射率而将不同波长的光分开。(1)(1)玻璃棱镜由于玻璃可吸收紫外光，玻璃棱镜只能用于玻璃棱镜由于玻璃可吸收紫外光，玻璃棱镜只

27、能用于350 3200 nm350 3200 nm的波长范围，能用于可见光域内。的波长范围，能用于可见光域内。(2)(2)石英棱镜石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从石英棱镜石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 185 4000nm4000nm，可用于紫外、可见和近红外三，可用于紫外、可见和近红外三 个光域个光域 。4 4 光栅光栅原理利用光的衍射与干涉作用制成的原理利用光的衍射与干涉作用制成的范围紫外、可见及红外光域，在整个波长区具范围紫外、可见及红外光域，在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。优点它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成优点它具有色

28、散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。本低、便于保存和易于制备等优点。缺点各级光谱会重叠而产生干扰缺点各级光谱会重叠而产生干扰,可用二维色散可用二维色散技术克服。技术克服。（三）吸收池（三）吸收池1 1、吸收池功能用于盛放分析试样、吸收池功能用于盛放分析试样2 2、材料、材料 玻璃玻璃能吸收能吸收UVUV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区 石英石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区。光区。3 3、要求匹配性（对光的吸收和反射应一致），、要求匹配性（对光的吸收和反射应一致），为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂为减少光的损失，吸收

29、池的光学面必须完全垂直于光束方向。直于光束方向。（四）检测系统（四）检测系统1 1 功能检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变功能检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。化的一种装置。2 2 检测器类型光电池、光电管和光电倍增管。检测器类型光电池、光电管和光电倍增管。3 3 硒光电池范围为硒光电池范围为300800nm300800nm，其中，其中500 500 600nm600nm最为灵敏。用于低档的分光光度计中。最为灵敏。用于低档的分光光度计中。4 4 光电管在紫外可见分光光度计上应用广泛。光电管在紫外可见分光光度计上应用广泛。5 5 光电倍增管检测微弱光最常用的光电元件，它的光

30、电倍增管检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比光电管要高灵敏度比光电管要高200200倍，因此可使用较窄的倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。辨能力。（五）显示系统（五）显示系统 作用放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用装置直读检流计、电位调节指零装置，数字显示或自动记录装置，现在用工作站。二、紫外可见分光光度计的类型二、紫外可见分光光度计的类型单光束分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计双光束分光光度计双波长分光光度计双波长分光光度计 特点：特点：使用时来回拉动吸收池（轮流通过参比溶液和样品使用时来回拉动吸

31、收池（轮流通过参比溶液和样品溶液）溶液）移动误差移动误差 结构简单，操作方便，维修容易结构简单，操作方便，维修容易（一）单光束分光光度计（一）单光束分光光度计光电倍增管光电倍增管切光器切光器光闸光闸比色皿比色皿单色器单色器单光束分光光度计原理图单光束分光光度计原理图（二）单波长双光束分光光度计（二）单波长双光束分光光度计 特点：特点：不用拉动吸收池不用拉动吸收池(同时通过参比溶液和待测溶同时通过参比溶液和待测溶液），可以减小移动误差液），可以减小移动误差 可以自动扫描吸收光谱可以自动扫描吸收光谱 光闸光闸单色器单色器切光器切光器参比参比光电倍增管光电倍增管双光束分光光度计原理图双光束分光光度计

32、原理图样品溶液样品溶液（三）双波长分光光度计单色器单色器吸收池接收器1122双波长分光光度计原理图双波长分光光度计原理图 特点：特点：定量基础：定量基础：A=AA=A 1 1-A-A 2 2 可消除干扰和吸收池不匹配引起的误差，不需要参可消除干扰和吸收池不匹配引起的误差，不需要参比溶液。比溶液。适用于分析多组分混合物，混浊试样（生物组织液）适用于分析多组分混合物，混浊试样（生物组织液）第三节第三节 LamberLamberBeerBeer定律定律 透射比和吸光度透射比和吸光度 LamberLamberBeerBeer定律定律 吸光系数吸光系数 偏离偏离LamberLamberBeerBeer定

33、律的因素定律的因素 透过光的强度透过光的强度(t)(t)和入射光强度和入射光强度(o)(o)之比称之比称为透光度（为透光度（T)T=t/oT)T=t/o 为表示物质吸收光的程度引入吸光度为表示物质吸收光的程度引入吸光度(A)(A)概念概念一一 、透光度和吸光度、透光度和吸光度toIILogTLogA1二二 、LamberBeerLamberBeer定律定律描述物质对单色光吸收强描述物质对单色光吸收强弱弱(吸光度）与吸光度）与液层厚度液层厚度和和待测物浓度待测物浓度的关系的关系CABeerlALamber定律：定律：A=Elc=E bc=bc=abcA=Elc=E bc=bc=abc吸光度的加和

34、性 如有一复杂试样，其中含有几个组分，各个组分都有各自的吸光系数，浓度c和吸光度A，那么溶液的吸光度等于各组分的吸光度之和 A=A1+A2+A3+An =1c1b+2c2b+3c3b+ncnb 例例1 1 某有色溶液，用某有色溶液，用1cm1cm比色皿时其透射比为比色皿时其透射比为T T，如改，如改用用2cm2cm比色皿时其透射比为多少？比色皿时其透射比为多少？解解 例例2 2 已知某一有机化合物，在波长已知某一有机化合物，在波长520 nm520 nm处的摩尔吸处的摩尔吸光系数为光系数为9.299.29104L/104L/（mol cm)mol cm)，今用，今用2cm2cm的吸收池，的吸收

35、池，在该波长处测得的吸光度为在该波长处测得的吸光度为0.890.89，求有色化合物的浓，求有色化合物的浓度？度？解解c=A/b=0.89/(9.29c=A/b=0.89/(9.291041042)=4.792)=4.791061061222lg10110210abcacacATabcTbcmTTbcmTT：三、吸光系数1 1吸光系数的物理意义单位浓度、单位厚度的吸光度吸光系数的物理意义单位浓度、单位厚度的吸光度E=A/(bc)E=A/(bc)当当b b以以cm,ccm,c以以g/Lg/L为单位时为单位时,吸光系数以吸光系数以a a表示表示:A=acb A=acb 当当b b以以cm,ccm,c

36、以以mol/Lmol/L为单位时为单位时,摩尔吸光系数以摩尔吸光系数以表示表示 A=cbA=cb四、偏离朗伯比尔定律的因素四、偏离朗伯比尔定律的因素 依据依据Lamber-BeerLamber-Beer定律，定律，A A与与C C关关系应为经过原点的直线。系应为经过原点的直线。偏离偏离Lamber-BeerLamber-Beer定律的主要因素定律的主要因素表现为以下两个方面。表现为以下两个方面。（一）光学因素（一）光学因素（二）化学因素（二）化学因素 A=bcA=bc（一）光学因素（一）光学因素 1 1非单色光的影响非单色光的影响 LamberBeerLamberBeer定律应用的重要前提定律

37、应用的重要前提入射光为单色光入射光为单色光 一般仪器所获得的入射光是具有一般仪器所获得的入射光是具有一定波长范围的复合光，由于物一定波长范围的复合光，由于物质对不同波长的光有不同的吸光质对不同波长的光有不同的吸光系数，从而使得吸光度的变化偏系数，从而使得吸光度的变化偏离离Lamber-BeerLamber-Beer定律定律 消除方法：选择较窄的入射狭缝消除方法：选择较窄的入射狭缝宽度和提高单色器分辨率决定宽度和提高单色器分辨率决定2 2杂散光的影响杂散光的影响 杂散光指与测量波长相同，在仪器内部不通过试杂散光指与测量波长相同，在仪器内部不通过试样而到达检测器的那部分辐射，以及单色器通样而到达检

38、测器的那部分辐射，以及单色器通带范围以外的额外辐射。带范围以外的额外辐射。杂散光来源仪器本身缺陷；光学元件污染（灰尘杂散光来源仪器本身缺陷；光学元件污染（灰尘散射，光学部件反射，散射）。散射，光学部件反射，散射）。当杂散光可以被试样吸收，所得的吸光度大于真当杂散光可以被试样吸收，所得的吸光度大于真实值，出现正偏差；若不被吸收，吸光度小于实值，出现正偏差；若不被吸收，吸光度小于真实值，出现负偏差。真实值，出现负偏差。消除办法提高仪器自身的性能。消除办法提高仪器自身的性能。3 3反射光和散射光的影响反射光和散射光的影响反射光（吸收池内外界面间产生的）和散射反射光（吸收池内外界面间产生的）和散射光（

39、颗粒较大的吸收质点产生的）均是入光（颗粒较大的吸收质点产生的）均是入射光谱带宽度内的光直接对射光谱带宽度内的光直接对T T产生影响，产产生影响，产生假吸收的现象，使生假吸收的现象，使TT，AA，吸收光谱，吸收光谱变形。变形。注一般可用空白对比校正消除。注一般可用空白对比校正消除。4 4非平行光的影响非平行光的影响使光程使光程，AA，吸收光谱变形，吸收光谱变形（二）化学因素 BeerBeer定律适用的另一个前提稀溶液；浓度过高定律适用的另一个前提稀溶液；浓度过高会使会使C C与与A A关系偏离定律。关系偏离定律。溶质浓度过高（溶质浓度过高（0.01mol/L),0.01mol/L),吸光物质分子

40、或吸光物质分子或离子间的平均距离缩小，使相邻吸光分子的电离子间的平均距离缩小，使相邻吸光分子的电荷分布相互影响，从而改变它对光的吸收能力荷分布相互影响，从而改变它对光的吸收能力 ，浓度越大，这种影响就越大。浓度越大，这种影响就越大。溶质浓度改变可能会引起其离解，缔合，光化溶质浓度改变可能会引起其离解，缔合，光化学反应，互变异构，络合物配位数变化等作用，学反应，互变异构，络合物配位数变化等作用，使被测组分的吸收曲线发生变化。使被测组分的吸收曲线发生变化。消除办法采用稀溶液分析消除办法采用稀溶液分析 第四节 分析条件的选择 仪器测量条件的选择仪器测量条件的选择 显色反应条件的选择显色反应条件的选择

41、 参比溶液的选择参比溶液的选择一一 仪器测量条件的选择仪器测量条件的选择 1 1，入射光波长的选择，入射光波长的选择 一般用最大吸收波长，如有一般用最大吸收波长，如有干扰则选用其他波长。干扰则选用其他波长。二二 显色反应条件的选择显色反应条件的选择（一（一 ）显色反应和显色剂）显色反应和显色剂1 1 显色反应被测元素（金属离子）在某种试剂作显色反应被测元素（金属离子）在某种试剂作用下用下,转变为有色化合物的反应转变为有色化合物的反应2 2 显色剂所用的试剂显色剂所用的试剂3 3 对显色反应的要求对显色反应的要求:（1 1）选择性好）选择性好（2 2）灵敏度要高）灵敏度要高（3 3）有色配合物的

42、组成一定并且稳定）有色配合物的组成一定并且稳定（二）影响显色反应的条件（二）影响显色反应的条件1 1 显色剂用量配位数与显色剂用量有关；在形成逐级显色剂用量配位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格控制配合物，其用量更要严格控制 2 2 溶液酸度配位数和水解等与溶液酸度配位数和水解等与 pH pH 有关有关3 3 显色时间、温度、放置时间显色时间、温度、放置时间通过条件实验确定显色反应条件通过条件实验确定显色反应条件pHpH范围范围配合物组成配合物组成颜色颜色44Fe(CFe(C7 7H H4 4OO3 3)+紫红色紫红色(1:1)(1:1)4-74-7Fe(CFe(C7 7H

43、H4 4OO3 3)2 2+棕橙色棕橙色(1:2)(1:2)8-108-10Fe(CFe(C7 7H H4 4OO3 3)3 3+黄色黄色(1:3)(1:3)三三 参比溶液的选择参比溶液的选择 参比溶液目的消除溶液中其它成分（溶剂，试剂，样品基体）以参比溶液目的消除溶液中其它成分（溶剂，试剂，样品基体）以及吸收池对光的反射和吸收所带来的误差及吸收池对光的反射和吸收所带来的误差 1.1.溶剂参比试样组成简单、共存组份少溶剂参比试样组成简单、共存组份少(基体干扰少基体干扰少)、显色剂、显色剂不吸收时，直接采用溶剂不吸收时，直接采用溶剂(多为蒸馏水多为蒸馏水)为参比；为参比；2.2.试剂参比当显色剂

44、或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂参比当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比试剂作参比(不加待测物不加待测物)；3.3.试样参比如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反试样参比如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，可以试样作参比应时，可以试样作参比(不能加显色剂不能加显色剂)第五节第五节 测定方法测定方法 单组分定量方法单组分定量方法 多组分定量方法多组分定量方法一 单组分定量方法1 1吸光系数法吸光系数法 2 2标准曲线法标准曲线法 定量依据定量依据：A=bcA=bc1吸光系数法 要求单色光前提：iECAmLgCigW 求含样过程：已知稀释)/(/)(l

45、ALmolCi/或%100%样CCiilEAmLgCi100/例维生素B12 的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度 例精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？mLgmLglEAC/0.20100/00200.01207414.0mLgmLgCi/1045.2100/1045.21207507.053mLgC/1050.2100101001050.252样

46、%0.98%1001050.21045.2%100%5512样CCBi2标准曲线法 前提固定测定条件和仪器条件CACKA样样同上条件固定条件查得测定样品曲线分别测定配制标准系列过程：CAACA标样标样标样标样AACCAACC芦丁含量测定二 多组分定量方法cbaAAAA总定量依据：1 1两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分在各自两组分在各自maxmax下不重叠下不重叠分别按单组分定量分别按单组分定量aaaaaaEACCEA1111由bbbbbbEACCEA2222由bbaaAEAE222111；测定；测定过程：2 2两组分吸收光谱部分重叠两组分吸收光谱部分重叠 1 1测测A A1 1bb组分不干扰组分不干扰可按单组分定量测可按单组分定量测C Ca a 2 2测测A A2 2aa组分干扰组分干扰不能按单组分定量测不能按单组分定量测C Cb bbabaaaAEEAE2222111；和测定；测定过程：aaaaaaEACCEA1111由bbaababaCECEAAA22222由baababECEAC222