第二章基因工程的基本原理课件.ppt

1、第二章基因工程的基本原理A 重组DNA技术的理论基础 基因工程的基本原理19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA1973年 伯格-杰克森-考恩-鲍耶 DNA分子体外拼接分子遗传学1953年 沃森-克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学基因工程B 基因的分子生物学 基因工程的基本原理C 基因工程的基本原理 基因工程的基本原理提高外源基因的剂量分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等列、mRNA非编码区、密码子等分子生物学原理

2、修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序 基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产生化工程学原理 分子生物学原理 D 基因工程的支撑技术 基因工程的基本原理核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术2.1 核酸的结构与功能核酸的结构与功能2.2 基因与基因组基因与基因组2.3 中心法则与基因表达调控中心法则与基因表达调控2.4 自然界的基因转移和重组自然界的基因转移和重组第二节第二节 基因工程的分子生物学基础基因工程的分子生物学基础2.1 核酸的结构与功能核酸：就是由许多核苷酸按照一定的顺序连接核酸：

3、就是由许多核苷酸按照一定的顺序连接所组成的多核苷酸，它的主要功能是充当遗传所组成的多核苷酸，它的主要功能是充当遗传信息的载体。信息的载体。脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸:DNA:DNA核糖核酸核糖核酸:RNA:RNA戊糖戊糖碱基碱基核苷酸的基本组成DNA的一级结构与功能的一级结构与功能结构式DNA的结构和功能的结构和功能DNA的二级结构与功能的二级结构与功能1 螺旋直径螺旋直径2nm2 链间有螺旋形凹槽，较链间有螺旋形凹槽，较小的为小沟（小的为小沟（1.2 nm），），较大的为大沟（较大的为大沟（2.2nm）3 碱基间距为碱基间距为0.34nm4 结构重复周期结构重复周期3.4nm5 每轮碱基数为每

4、轮碱基数为106 碱基平面与纵轴垂直。碱基平面与纵轴垂直。RNA的结构与功能信使信使RNA（messenger RNA，mRNA）核糖体核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）转运转运RNA（transfer RNA，tRNA）mRNA1.mRNA的转录和翻译发生在同一个细胞空间，这两个过程几乎是同步进行的。2.半衰期短。3.许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在。4.原核生物mRNA的5端无帽子结构，3端没有或只有较短的多聚（A）结构。5.原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子 真核细胞mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内。单顺反子形式存在。

5、5端存在“帽子”结构。绝大多数具有多聚(A)尾巴。真核生物几乎永远以AUG作为起始密码子。rRNA49种蛋白质种蛋白质60S亚基亚基28S rRNA5.8S rRNA5S rRNA40S亚基亚基18S rRNA33种蛋白质种蛋白质50S亚基亚基23S rRNA5S rRNA36种蛋白质种蛋白质30S亚基亚基16s rRNA21种蛋白质种蛋白质高等动物核糖体（高等动物核糖体（80S80S）E.coli核糖体（核糖体（70S）tRNA二级结构二级结构 三级结构三级结构核酸的理化性质及其应用一般理化性质一般理化性质DNA为白色纤维状固体RNA为白色粉末状固体紫外吸收：260nmA260/A280值可

6、以反映核酸的纯度。纯的DNA：A260/A280=1.8纯的RNA：A260/A280=2.0DNADNA变性变性 在某些理化因素下，在某些理化因素下，DNA分子互补碱基之间的氢键断分子互补碱基之间的氢键断裂，致使裂，致使DNA双螺旋结构松开，变成单链，即为双螺旋结构松开，变成单链，即为DNA变性变性（denaturation）。引起变性的因素有：加热、酸碱、尿素、）。引起变性的因素有：加热、酸碱、尿素、甲醛等。甲醛等。核酸变性后，在核酸变性后，在260nm处的吸收值上升，这叫增色效处的吸收值上升，这叫增色效应应(hyperchromic effect)。增色效应常可用来衡量。增色效应常可用来

7、衡量DNA变变性的程度。性的程度。核酸的理化性质核酸的理化性质 热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为（双螺旋结构失去一半）时的温度称为DNADNA的熔点或的熔点或熔解温度（熔解温度（TmTm）。）。DNADNA变性变性热变性曲线热变性曲线 (熔解曲线熔解曲线)在在DNADNA发生热变性发生热变性的过程中，的过程中，A260A260随随温度的变化曲线温度的变化曲线影响Tm值的因素?变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复为天然的双螺旋结构，这种现象称为复性（renaturation）。DNA单链之间、一条DNA

8、和一条RNA链之间主要存在序列互补配对区域，不管是整条链互补，还是部分序列互补，均可能重新形成整条双链或部分双链，这即为核酸分子杂交（hybridization）。复性和杂交复性和杂交2.2 基因与基因组基因的结构基因（基因（gene）：能够编码一段多肽或功能）：能够编码一段多肽或功能RNA的一段核苷酸序列。的一段核苷酸序列。基因的基本特性：基因可自我复制基因的基本特性：基因可自我复制 基因决定性状基因决定性状 基因可以突变基因可以突变 基因的分类：结构基因基因的分类：结构基因 调控基因调控基因原核生物基因结构原核生物基因结构 操纵子操纵子(operon)机制机制其他调节序列其他调节序列编码序

9、列编码序列(promoter)操纵序列(operator)启动序列启动序列真核生物基因结构真核生物的结构基因不仅在两侧有非编码区，真核生物的结构基因不仅在两侧有非编码区，而且在基因内部也有许多不编码蛋白质的间隔而且在基因内部也有许多不编码蛋白质的间隔序列，即内含子（序列，即内含子（intronintron），编码区则成为外），编码区则成为外显子（显子（exonexon）。）。终止子（终止子（terminatorterminator）基因结构中能够促进转）基因结构中能够促进转录终止的录终止的DNADNA序列，在序列，在RNARNA水平上通过转录出的水平上通过转录出的终止子序列形成茎环结构而终止。

10、终止子序列形成茎环结构而终止。基因组原核生物的基因组原核生物的基因组基因组小基因组小多顺反子多顺反子mRNAmRNA非编码区少非编码区少基因重叠基因重叠不含内含子不含内含子基因组（基因组（genome）：单倍体细胞中的全套染色体）：单倍体细胞中的全套染色体上所有基因的总和。上所有基因的总和。真核生物基因组真核生物基因组同源基因组同源基因组基因组大基因组大单顺反子单顺反子重复序列重复序列非编码序列非编码序列90%90%以上以上基因家族基因家族转座子转座子/逆转座子逆转座子2.3 中心法则与基因表达调控生物信息的传递生物信息的传递原核生物基因的表达调控原核生物基因的表达调控真核生物基因的表达调控真

11、核生物基因的表达调控2.3.1 生物信息的传递生物信息的传递DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制 复制的起始复制的起始(initiation)DNA链的延伸链的延伸(elongation)复制的终止复制的终止(termination)DNA复制的基本过程复制的基本过程转录的基本过程转录的基本过程 模板识别模板识别(Template Recognition)转录起始转录起始(Initiation)转录的延伸转录的延伸(Elongation)转录的终止转录的终止(Termination)蛋白质的生物合成氨基酸活化肽链的起始肽链的延伸肽链的终止新合成多肽链的折叠和加工转录水平上的调控mRN

12、A加工成熟水平上的调控翻译水平上的调控2.3.2 基因的表达调控基因的表达调控32lacI调节基因调节基因lacZlacYlacADNAmRNA-GalactosidasePermeaseTransacetylaseProtein结构基因结构基因PlacIPlacOlacThe LAC operon原核生物基因的表达调控原核生物基因的表达调控阻遏蛋白的负调控阻遏蛋白的负调控调控基因调控基因CAPCAP正调控正调控真核生物基因的表达调控真核生物基因的表达调控DNA水平的调控转录水平的调控(transcriptional regulation)转录后水平的调控(post transcription

13、al regulation)翻译水平的调控(translational regulation)翻译后水平的调控(protein maturation)真核生物基因表达调控的特点和种类真核生物基因表达调控的特点和种类真核生物真核生物DNADNA水平上的基因表达调控水平上的基因表达调控 真核生物转录水平上的基因表达调控真核生物转录水平上的基因表达调控 顺式作用元件和反式作用因子顺式作用元件和反式作用因子真核基因他水平上的调控真核基因他水平上的调控 RNA RNA的加工成熟、翻译水平的调控、翻译后水平的调控的加工成熟、翻译水平的调控、翻译后水平的调控基因丢失基因丢失基因扩增基因扩增基因重排基因重排D

14、NADNA甲基化状态与调控甲基化状态与调控染色质结构与调控染色质结构与调控DNaseI超敏感位点基因座控制区（LCR）核基质结合区（MAR）2.4 自然界的基因转移和重组接合作用细菌之间通过菌毛相互接触时，质粒便可从一个细胞转移至另一细胞，这种类型的DNA转移称为接合作用（conjugation）。转化作用（转化作用（transfromationtransfromation）通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNADNA，使细胞，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。或培养的受体细胞获得新的遗传表型。转导作用（转导作用（transductiontransduction）

15、当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来再次当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的受体细胞之间的DNADNA转移及基因重组方式。转移及基因重组方式。转化及转导转化及转导溶菌途径溶菌途径溶源途径溶源途径噬菌体感染宿主的结果噬菌体感染宿主的结果:第三节 基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术基本原理基本原理(PCRPolymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应聚合酶链式反应)一个一个D

16、NA经经n次扩增后次扩增后,一个一个DNA分子可变为分子可变为2n个分子个分子DNA扩增需要对待扩增的扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物。PCR 技术技术反应体系反应体系 DNA模板；模板；dNTPs；+TrisHCl缓冲液；引物；缓冲液；引物；DNA聚聚合酶合酶循环循环 90变性变性30；50退火退火30；75延伸延伸 1；进入第；进入第N次循次循环环。90 变 性 解 链与 引 物 退 火，50引 物 及 延 伸，75n次 扩 增第一次循环第二次循环35353553

17、5335533533533555355390 变 性 解 链与 引 物 退 火，505335533553355335引 物 及 延 伸，753353355533533555PCR原理示意图原理示意图锚定锚定PCR（Anchored PCR，A-PCR）或称）或称RACE5 3 5 3 3 5PCRTdTdGTP5 3 3 55 3 G.G 3 55 C.C 3 G.G 3 55 C.C 3 G.G 3 5 PCR 种类种类反向反向PCR（inverse PCR）该法可用于扩增已知该法可用于扩增已知 序列两侧的未知序列序列两侧的未知序列R2 X LigaseY R1 Y X Z R2 R1 P1

18、 Z R2P2反转录反转录PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR)主要用于主要用于mRNA的的PCR扩增扩增 mRNA引物15RT53AAA.A3TTT.T53AAA.ARNaseH53TTT.T53AAA.A53TTT.T53AAA.A53TTT.T535353RT53TTT.TTdT+dGTPGG.GCC.C 限制酶识别序列 限制酶识别序列RT-PCR有时候也会指代实时有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转。为了与逆转录录PCR相区别，通常被写作相区别，通常被写作“定量定量PCR”(quantitative PCR)或者或者R

19、TQ-PCR(real-time quantitative PCR)。实时实时PCR(real-time PCR)，属于定量，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，）的一种，以一定时间内以一定时间内DNA的增幅量为基础进行的增幅量为基础进行DNA的定量分析。的定量分析。定量定量PCR（Q-PCR）还有半定量）还有半定量semi quantitative PCR。real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸

20、序列相结合的一种萤光探针（序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。）。荧光定量荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。TaqMan荧光探针：荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，扩增

21、时，Taq酶的酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全产物形成完全同步。同步。在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，荧光染料，SYBR荧光染料荧光染料非特异性地掺入非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分

22、子不发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增染料分子不发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与加与PCR产物的增加完全同步。产物的增加完全同步。SYBRSYBR荧光染料：荧光染料：加端加端PCRPCR（Add-on PCRAdd-on PCR）在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列：在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列：如某种限制酶的识别序列，某一基因的调控或其它必需序列如某种限制酶的识别序列，某一基因的调控或其它必需序列错配错配PCRPCR（mismatched PCR)mismatched PCR)P1 P3 P2 靶顺序 P4 分别扩增 5 3 3 5 5 3 3 5除去引物变性/

23、复性P1 P4 产生点突变DNAPCR延伸3553利用该法可在一已知利用该法可在一已知DNA序列中引起点突变，缺失突变和插入突变。序列中引起点突变，缺失突变和插入突变。重组重组 PCR PCR（Recombinant PCRRecombinant PCR）与基 因2启 动子同 源基因 1编码 区PCR53变性/复性启动 子与基 因1编 码区同 源PCR533553355335链延 伸基因 23553利用该法可将不同基因的利用该法可将不同基因的DNA片段连接在一起。片段连接在一起。分子杂交技术分子杂交技术按其分子种类划分按其分子种类划分 DNA杂交杂交 探针为探针为DNA或或RNA RNA杂交杂

24、交 探针为探针为DNA或或cDNA 蛋白质免疫分析蛋白质免疫分析 探针为抗体探针为抗体RNA DNA DNA RNA 蛋白质原位杂交原位杂交(in situ hybridization)(in situ hybridization)i.i.原位菌落杂交原位菌落杂交 ii.ii.原位噬菌斑杂交原位噬菌斑杂交 iii.iii.原位细胞杂交原位细胞杂交 iv.iv.原位组织块杂交原位组织块杂交斑点杂交斑点杂交(dot hybridization)(dot hybridization)先分离先分离DNADNA，RNARNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂

25、交，不能测定分子量大小。基质上进行杂交，不能测定分子量大小。按其样品制备划分按其样品制备划分转移杂交或印迹杂交转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization)(blotting hybridization)先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方法有：的方法有：i.i.扩散法扩散法 ii.ii.毛细管法毛细管法 iii.iii.电泳转移法电泳转移法 iv.iv.真空转移法真空转移法夹

26、心杂交法夹心杂交法(sandwich hybridization)(sandwich hybridization)它利用两种探针与待测它利用两种探针与待测DNADNA结合，先将不带标记的探针固定在基结合，先将不带标记的探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制二种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制DNADNA样品，可检测样品，可检测出出0.2ng0.2ng的的DNADNA样品样品分子杂交的一般程序分子杂交的一般程序DNADNA和和RNARNA的杂交的杂交 制备制备DNAD

27、NA或或RNARNA样品；样品；与固定基质结合；与固定基质结合；8080真空固定；真空固定；预杂交；预杂交；加入标记探针杂交；加入标记探针杂交；洗涤；洗涤；放射自显影或显色反应。放射自显影或显色反应。蛋白质的免疫分析蛋白质的免疫分析制备蛋白质样品与固定基质结合；制备蛋白质样品与固定基质结合；常温空气中固定；常温空气中固定；封闭剂封闭；封闭剂封闭；一抗反应；一抗反应；洗涤；洗涤；二抗二抗-酶偶联物反应；酶偶联物反应；洗涤；洗涤；显色反应（显色反应（EIA）；）；或或 一抗放射标记物一抗放射标记物洗涤洗涤放射自放射自显显 影（影（RIA）探针的制备探针的制备32P，3H，35S用于核酸标记，其中用

28、于核酸标记，其中32P和和35S使用频率高。使用频率高。32P标记核苷酸的标记核苷酸的位或位或位，位，35S则是标记核苷酸的则是标记核苷酸的位；位；125I，3H，14C用于蛋白质标记。用于蛋白质标记。放射性同位素标记物放射性同位素标记物非放射性标记物非放射性标记物半抗原半抗原 包括地高辛配体，汞，包括地高辛配体，汞，2-乙酰胺二苯丙茂和金属铕。乙酰胺二苯丙茂和金属铕。地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在dUTP上，然后用酶将上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗-酶偶联物酶偶联物反

29、应和显色反应。反应和显色反应。生物素生物素核酸探针是与基因部分互补的一短的核酸探针是与基因部分互补的一短的DNA或或RNA碱基序列，核酸探针可碱基序列，核酸探针可以与基因杂交。以与基因杂交。标记探针的制备标记探针的制备链标记法链标记法 i.切口移位法切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP)ii.随机随机DNA引物延伸法引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段片段+dNTP(32P)iii.反转录法反转录法 mRNA+dNTP(32P)cDNA（标记）（标记）iv.转录法转录法 含有待标记含有待标记DNA片段的重组质粒片段

30、的重组质粒+NTP(32P)RNA（标记）（标记）SP6聚合酶聚合酶 v.引物延伸法引物延伸法 含待标记含待标记DNA的单链的单链DNA分子分子(M13mp系系列列)+引物引物(15-17n.t)+dNTP(32P)待标记待标记DNA链链 vi.T4 DNA聚合酶法聚合酶法 ds-DNAT4 DNA聚合酶聚合酶,无无dNTP3-5外切酶活性外切酶活性加入加入dNTP和标记核苷酸和标记核苷酸新合成链（新合成链（32P）末端标记末端标记 5-末端标记末端标记 ss-和和ds-DNA,RNA脱磷酸化反应脱磷酸化反应(CIP)T4DNA激酶激酶(-32P)ATP 3-末端标记末端标记 TdT加尾反应，用于加尾反应，用于dsDNA补齐反应补齐反应5 3 3 5 TdT-dCTP32P5 3CCCC *CCCC 3 5 *5 3 3 5 Klenow片段-dNTP32P5 3 3 5 杂交结果示意图杂交结果示意图谢谢！