第十一章核酸体外扩增课件.ppt

1、第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增 本章讨论本章讨论3个问题：个问题：第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增 dsss ds（热变性）（热变性）ss DDDP（II）耐热的耐热的Taq酶酶 有有3 5外切酶活性外切酶活性 有有5 3外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性 无无3 5 外切酶活性外切酶活性 RNA DNA 37 94，55，70-72核酸体内扩增和核酸体外扩增核酸体内扩增和核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增ABab5353引物引物a与与A链一致，在链一致，在5端，与端，与B链互补，所以链互补，所以 为了获得基因诊断的材料。进行基因定量（表达异

2、常）和进为了获得基因诊断的材料。进行基因定量（表达异常）和进行基因定性（结构异常）以及获取研究的材料。行基因定性（结构异常）以及获取研究的材料。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增 PCR-所谓所谓PCR，又称体外酶促基因扩增，是利用，又称体外酶促基因扩增，是利用DNA聚合酶依赖聚合酶依赖DNA模板的特征，模仿体内模板的特征，模仿体内DNA的复制过程，的复制过程，在附加的一对引物之间诱导的聚合酶反应。在附加的一对引物之间诱导的聚合酶反应。基本原理：基本原理：在模板、引物、在模板、引物、4种种dNTP和赖热和赖热DNA聚合酶存在的条件聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的下，特异

3、扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成区段的酶促合成反应。反应。第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增一、一、PCR的基本原理的基本原理 PCR是一种选择性体外扩增是一种选择性体外扩增DNA或或RNA片段的方法。其特异性是由两片段的方法。其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡核苷酸，其本质是片段两翼互补的寡核苷酸，其本质是ssDNA片段。待扩增片段。待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条

4、模板加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼的两翼序列特异复性。此时两引物序列特异复性。此时两引物3端相对，端相对，5端相背。在合适条件下，由端相背。在合适条件下，由Taq（或其他）（或其他）DNA聚合酶催化引物引导的聚合酶催化引物引导的DNA合成，即引物的延伸。合成，即引物的延伸。上述过程是由温度控制的。这种热变性上述过程是由温度控制的。这种热变性复性复性延伸的过程就是一个延伸的过程就是一个PCR循环（图循环（图11-1）。）。PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。延就是在合适条件下的这种循环的不断重复。延伸产物经第二循环变性后，亦与引物互补，作为引物引导伸产物经第二循环变性后，亦与引

5、物互补，作为引物引导DNA合成的新模合成的新模板。因此，第二循环后，延伸的模板由第一循环的板。因此，第二循环后，延伸的模板由第一循环的4条增加为条增加为8条（包括原条（包括原始模板在内），依此类推，以后每一循环后的模板均比前一模板增加一倍。始模板在内），依此类推，以后每一循环后的模板均比前一模板增加一倍。理论上，扩增理论上，扩增DNA的产量是指数上升的，即的产量是指数上升的，即n个循环后，产量为个循环后，产量为2n拷贝。拷贝。图图11-1明显指明了扩增片段的末端是由两引物明显指明了扩增片段的末端是由两引物5端限定的。端限定的。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增 -在摩尔数大大过量在摩尔数

6、大大过量的两段寡核苷酸及的两段寡核苷酸及4种种dNTP参入下，对模板参入下，对模板DNA进行加热变性，通过加进行加热变性，通过加热使热使DNA双螺旋氢键断裂，双链解离形成单链双螺旋氢键断裂，双链解离形成单链DNA。（。（denaturation）。）。-将反应混合液冷却至某将反应混合液冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火。当温度突然降低时，一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火。当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大量大大多于模板多于模板DNA，使引物与其互补模板在局部形成杂交

7、链，而模板双链之，使引物与其互补模板在局部形成杂交链，而模板双链之间互补的机会较少。间互补的机会较少。-在底物在底物4种种dNTP及及Mg2+存在的条件下，存在的条件下，DNA聚合酶催化以引物为起始点的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链按链按5-3方方向进行延伸反应。以上向进行延伸反应。以上3步为一个循环。步为一个循环。在在PCR仪（或手动仪（或手动PCR）作用下，如此反复进行变性、退火和延伸）作用下，如此反复进行变性、退火和延伸循环，从而使产物迅速得到扩增。几十轮反应仅需数小时，介于两个引循环，从而使产物迅速得到扩增。几十轮反应仅需数小时，介于两个引物之间的特异性物之间的特异性DNA片段可得

8、到大量复制，数量可过片段可得到大量复制，数量可过2106-2107拷贝。拷贝。有人将这一过程描述成：有人将这一过程描述成：第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增基本步骤：基本步骤：变性：加热使双链变性：加热使双链DNA变为单链变为单链 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链链 延伸：耐热延伸：耐热DNA聚合酶按聚合酶按53方向催化以引方向催化以引物为起始点的延伸反应物为起始点的延伸反应第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增PCR的基本原理的基本原理 示意图示意图第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增二、二、PCR引物设计原则引物设计原则 在在P

9、CR反应中使用的耐热反应中使用的耐热Taq（或其他）（或其他）DNA聚合酶，聚合酶，相应的缓冲体系及相应的缓冲体系及dNTP（核苷三磷酸）已经商品化，可从相（核苷三磷酸）已经商品化，可从相应公司购买现成待用的，但有两个关键成份是有待研究人员应公司购买现成待用的，但有两个关键成份是有待研究人员准备的：第一个是核酸模板（我们放在引物设计原则之后讨准备的：第一个是核酸模板（我们放在引物设计原则之后讨论），不能有污染，不能有聚合酶抑制剂。第二个是寡核苷论），不能有污染，不能有聚合酶抑制剂。第二个是寡核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成败的关键。酸引物的选择，通常是整个扩增反应成败的关键。PCR引物设

10、计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其有效扩增模板其有效扩增模板DNA序列，引物的优劣直接关系到序列，引物的优劣直接关系到PCR的特的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保成功，但遵循下述原则，则有助于引物的设计。则确保成功，但遵循下述原则，则有助于引物的设计。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（至少（至少2个引物互补序列是已知的），个引物互补序列是已知的），在片断两侧确定引物序列。在片断两侧确定引物序列。一般为一般为15-30个核苷酸，可以据需要设计的更长一些，个核苷

11、酸，可以据需要设计的更长一些，但至多到但至多到50个核苷酸左右。（注：引物的有效长度个核苷酸左右。（注：引物的有效长度Ln=2（G+C）+（A+T），），Ln值不能大于值不能大于38，否则，最适延伸温度会超过，否则，最适延伸温度会超过Taq聚合酶最聚合酶最适温度，不能保证产物的特异性）。适温度，不能保证产物的特异性）。引物中引物中4种碱基分布最好是随机的，避免出现种碱基分布最好是随机的，避免出现嘌呤嘧啶堆积现象，嘌呤嘧啶堆积现象，G+C含量为含量为40%-60%。（。（Tm值是寡核苷酸的值是寡核苷酸的解链温度，即在一定的盐浓度条件下，解链温度，即在一定的盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链温度

12、，有寡核苷酸双链解链温度，有效启动温度（效启动温度（Tp）一般高于）一般高于Tm值值5-10。若按公式。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T），估计引物），估计引物Tm值，则有效引物值，则有效引物Tm为为55-80，其，其Tm值最好接值最好接近近72以便复性条件最佳）。以便复性条件最佳）。引物自身不应存在互补序列，（避免引引物自身不应存在互补序列，（避免引物自身成发卡结构或引物本身复性，这种二级结构会因空间位阻效应影物自身成发卡结构或引物本身复性，这种二级结构会因空间位阻效应影响引物与模板复性结合，若人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于响引物与模板复性结合，若人工判断，引物自身连续互补碱基

13、不能大于3bp）。引物之间不应有互补性，尤应避免互补重叠，（以防引物二聚）。引物之间不应有互补性，尤应避免互补重叠，（以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于体的形成。一对引物间不应多于4个碱基的同源性或互补性）。个碱基的同源性或互补性）。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增 与模板与模板DNA一定要配对，（引物的延伸是从一定要配对，（引物的延伸是从3端开始端开始的，不能进行任何修饰）。有资料表明的，不能进行任何修饰）。有资料表明3端末位碱基在很大程度上影响端末位碱基在很大程度上影响Taq酶延伸效率，当末位为酶延伸效率，当末位为A时，即使错配，也能引发链的合成，（时，即使错配，也能引发链的

14、合成，（A：A错配使错配使产量下降至产量下降至1/20；A：G和和C：C错配下降至错配下降至1/100）。而末位为）。而末位为T时，错配引时，错配引发效率会大大降低，因发效率会大大降低，因G或或C居中间，所以居中间，所以3端末位碱基最好选端末位碱基最好选T、C或或G，而不选而不选A。5端界定着端界定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，产物的长度，它对扩增特异性影响不大，末端碱基无严格限制，甚至可不与末端碱基无严格限制，甚至可不与DNA模板匹配呈游离状态，但末端碱基最模板匹配呈游离状态，但末端碱基最好是好是G或或C（3对氢键），使对氢键），使PCR产物的末端结合稳定。产物的末端结合稳定。

15、引物与模板结合时，最多可以游离十几个碱基而不引物与模板结合时，最多可以游离十几个碱基而不影响影响PCR扩增的特异性，因此，扩增的特异性，因此，5端可以被修饰，引物端可以被修饰，引物5端修饰包括：端修饰包括：，可使，可使PCR产物克隆效率更高；产物克隆效率更高；，起始密码子或终止密码子；，起始密码子或终止密码子；，地高辛，荧光素等；，地高辛，荧光素等；使末端为平端的使末端为平端的PCR产物使其磷酸化克产物使其磷酸化克隆到通用载体上。隆到通用载体上。5端上游不应少于端上游不应少于3个核苷酸，否则切不个核苷酸，否则切不开，有些酶（如开，有些酶（如Hind）至少需要）至少需要7个核苷酸，个核苷酸，5G

16、GGTGACAAGCTT3 如有可能，最好把位点放在引物的中间，将引物设计为如有可能，最好把位点放在引物的中间，将引物设计为25-30个核苷酸。个核苷酸。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增 PCR引物设计原则要点引物设计原则要点 1.长度为长度为1530个核苷酸个核苷酸 2.碱基随机分布，碱基随机分布，G+C的含量为的含量为4555%3.避免发夹结构的形成，引物的存在连续互补序列不避免发夹结构的形成，引物的存在连续互补序列不超过超过3bp 4.引物之间不应存在互补序列，避免引物之间不应存在互补序列，避免3 端互补重叠端互补重叠 5.引物的碱基序列与非扩增区域无同源性引物的碱基序列与非扩增

17、区域无同源性 6.引物引物3 端碱基一定与模板配对，最佳碱基选端碱基一定与模板配对，最佳碱基选G和和C 7.引物引物5 端可以修饰，如加酶切位点，突变位点，起端可以修饰，如加酶切位点，突变位点，起始密码子，终止密码子等。始密码子，终止密码子等。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增三、模板制备三、模板制备 模板的取材主要依据模板的取材主要依据PCR扩增对象及各学科的专业扩增对象及各学科的专业知识而定。模板（或知识而定。模板（或PCR的标本）经适当处理方可使用。的标本）经适当处理方可使用。因为处理：因为处理：1、使待扩增、使待扩增DNA暴露，能与引物复性；暴露，能与引物复性；2、去除抑制、去除

18、抑制TaqDNA聚合酶杂质，在制备聚合酶杂质，在制备RNA模板模板时要防止时要防止RNA降解。降解。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（一）（一）DNA模板制备模板制备 1.去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸 2.水煮沸溶解细胞水煮沸溶解细胞 3.要求并不严格要求并不严格 4.模板用量低，哺乳动物基因组模板用量低，哺乳动物基因组DNA1g，质粒，质粒DNA0.1ng第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（二）（二）RNA模板的制备模板的制备 1.RNA提取试剂盒提取试剂盒 2.酸性硫氰酸胍酸性硫氰酸胍-酚酚-氯仿法氯仿法 3.异硫胍氯化铯密度梯度分

19、离法异硫胍氯化铯密度梯度分离法 4.SDS-酚酚-氯仿法氯仿法第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（三）模板的取材（三）模板的取材 模板（模板（PCR样本）可来源于病原微生物，组织细样本）可来源于病原微生物，组织细胞，血迹精斑，羊水尿样等。关于模板胞，血迹精斑，羊水尿样等。关于模板DNA或或RNA制制备请参看实验讲义。备请参看实验讲义。1.病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等克次体、支原体等 2.病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等 3.法医学标本：血斑、精斑、毛发法医学标本：血斑、精斑、毛

20、发 4.考古标本考古标本第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增四、四、PCR的基本反应的基本反应 在此处仅列出一般在此处仅列出一般PCR操作过程，具体各种影响因素的操作过程，具体各种影响因素的优化（优化（PCR反应条件的控制）将在下面讨论，每一具体操作反应条件的控制）将在下面讨论，每一具体操作前都要进行必要的优化。前都要进行必要的优化。反应体积：反应体积：50100l缓冲液缓冲液引物引物底物：底物：4种种dNTP模板：模板：102105拷贝拷贝TaqDNA聚合酶聚合酶矿物油矿物油第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增 50mmol/L kcl 10mmol/L TrisHcl mmol/L

21、（室温（室温PH8.3）1.5mmol/L Mgcl2 100g明胶或明胶或BSA 引物引物1.2各各0.25mol 4种底物（种底物（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）各）各200mol 模板模板DNA0.1g Taq聚合酶聚合酶2.5单位单位 模板模板DNA的用量需根据分子的大小加以调整，一般需含的用量需根据分子的大小加以调整，一般需含102-105拷贝的拷贝的DNA，封上矿物油，防止高温反应时液体挥发，以防污，封上矿物油，防止高温反应时液体挥发，以防污染。染。反应条件反应条件94变性变性30s，55退火退火30s，70-72延伸延伸30-60s，共进行共进行30次左右的循环。次左右

22、的循环。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增1）按以下顺序，将各成分在）按以下顺序，将各成分在0.5ml无菌离心管混合：无菌离心管混合：无菌水无菌水 30l 10Buffer 10l 4种种dNTP，每种浓度为，每种浓度为1.25mmol/L 16l 引物引物1（5pmol/l）5l 引物引物2（5pmol/l）5l 模板模板DNA0.1-1.0g （）（）l 加水至终体积加水至终体积 100l 2）将溶液混匀，）将溶液混匀，15000rpm10s。3）95加热混合液加热混合液7分钟，使分钟，使DNA完全变性。完全变性。4）将）将0.5l（2.5单位）单位）Taq酶加入混合液中（也有先加酶

23、）。酶加入混合液中（也有先加酶）。5）封上矿物油）封上矿物油100l。6）按下述条件）按下述条件PCR：循环循环 变性变性 退火退火 聚合聚合首轮循环首轮循环 945Min 501Min 721Min后续循环后续循环 941Min 501Min 721Min末轮循环末轮循环 941Min 501Min 727Min 7）末轮循环后不再变性，）末轮循环后不再变性，15000rpm2Min，将反应转入另一小管中，将反应转入另一小管中，-20保存。保存。8）从反应物取出扩增）从反应物取出扩增DNA凝胶电泳，凝胶电泳，southern杂交或测序分析。杂交或测序分析。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外

24、扩增第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增 （1）将无菌）将无菌Eppendorf管置冰上，混合：管置冰上，混合：mRNA（1g/l）10.0l Oligo（dT）12-18（1g/ml）10.0l 1mol/Tris-cl（PH7.6）2.5l 1mol/kcl 3.5l 250mmol/L Mgcl2 2.0l 4种种dNTP，每种浓度均为，每种浓度均为5mmol/L 10.0l 0.1mol/L DTT 2.0l RNA酶抑制剂酶抑制剂 25.0单位单位 加水至加水至 48l 可用可用10-50pmol用于用于PCR扩增上游寡核苷酸引物（被扩增上游寡核苷酸引物（被3引物或向前合引物或向

25、前合成引物）代替成引物）代替Oligo（dT）作引物，上游引物与初始）作引物，上游引物与初始mRNA互补，下游引互补，下游引物与（物与（5引物或向后合成引物）与引物或向后合成引物）与cDNA第一链互补。第一链互补。1、逆转录，以、逆转录，以mRNA为模板合成为模板合成cDNA第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（2）加入逆转录酶（）加入逆转录酶（MMLV）（）（Moloney小鼠白血病病毒逆转录小鼠白血病病毒逆转录酶），轻轻振荡，免泡沫产生，因酶），轻轻振荡，免泡沫产生，因MLV逆转录酶含逆转录酶含TritoX-100，必，必要时可离心片刻去泡沫。要时可离心片刻去泡沫。（3）37温育温育1

26、h，（逆转录）。，（逆转录）。（4）955分钟，灭活逆转录酶。分钟，灭活逆转录酶。（5）在无菌）在无菌0.5mlEp管中混合下液：管中混合下液：无菌水无菌水 30l 10Buffer 10l 4种种dNTP，每种浓度为，每种浓度为1.25mmol/L 16l 上游引物（上游引物（5pmol/l）5l 下游引物（下游引物（5pmol/l）5l 逆转录反应混合液逆转录反应混合液 5l 加水至终体积加水至终体积 100l第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增 普通普通PCR 与与 RT-PCR区别区别 1、反应步骤、反应步骤 一个阶段（一个阶段（DNAPCR）分两个阶段（逆转录、分两个阶段（逆转录

27、、cDNAPCR）2、反应体系、反应体系 （1）模板）模板 DNA mRNA，cDNA （2）引物）引物 上、下游引物上、下游引物 上、下游引物上、下游引物 （3）酶）酶 TaqDNA聚合酶聚合酶 逆转录酶、逆转录酶、Taq酶酶 （4）底物）底物 4种种dNTP 4种种dNTP （5）缓冲体系）缓冲体系 离子浓度和溶液离子浓度和溶液 PH有区别有区别 酶保护剂酶保护剂 BSA DTT 关于引物摩尔数计算关于引物摩尔数计算 PCR反应中，引物以反应中，引物以pmol数表示，合成引物后，引物量以数表示，合成引物后，引物量以OD值表示，换算如值表示，换算如下：下：OD为为1的引物为的引物为33g 引

28、物的分子量引物的分子量=碱基数碱基数330 引物引物pmol数数=OD值值33100000/碱基数碱基数330=OD值值10000/碱基数碱基数33第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增 PCR是酶促核酸体外扩增，扩增过程遵循酶催化动力学原理，反应是酶促核酸体外扩增，扩增过程遵循酶催化动力学原理，反应初期，初期，DNA量指数增加，随着场物积累，引物量指数增加，随着场物积累，引物-模板模板-酶达到一定比例时，酶达到一定比例时，酶催化反应趋于饱和，酶催化反应趋于饱和，DNA增加减慢进入相对稳定状态，出现增加减慢进入相对稳定状态，出现“停滞效停滞效应应”，这种效应称，这种效应称“平台期效应平台期效

29、应”，平台效应可能与下述因素有关：，平台效应可能与下述因素有关：1、dNTP、引物浓度降低；、引物浓度降低；2、随产物增加，酶与模板比例下降；、随产物增加，酶与模板比例下降；3、变性温度（、变性温度（93-95）和温度循环使酶活力和）和温度循环使酶活力和dNTP稳定性下降；稳定性下降；4、非特异产物或引物二聚体与反应物竞争；、非特异产物或引物二聚体与反应物竞争；5、产物在高浓度变性不完全，影响引物的延伸；、产物在高浓度变性不完全，影响引物的延伸；6、产物高于、产物高于10-8mol/L时，可影响时，可影响Taq酶延伸和加工能力；酶延伸和加工能力；7、酶与、酶与PCR产物结合，酶分子减少。产物结

30、合，酶分子减少。Taq酶特异性，忠实性较好，一般用酶特异性，忠实性较好，一般用Taq酶。酶。若进入平台期（一般难避免），产物仍不够用（一般够用）可稀释若进入平台期（一般难避免），产物仍不够用（一般够用）可稀释产物产物DNA样品样品103-104倍后，进行新的倍后，进行新的PCR。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增1.模板核酸模板核酸2.引物引物0.10.5mol/L3.1050mmol/L Tris-C4.1.5mmol/L5.20200 mol/L6.Taq DNA聚合酶聚合酶7.温度循环参数温度循环参数第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增五、五、PCR反应条件的控制反应条件的控制

31、（PCR条件的优化）条件的优化）102-105拷贝的靶序列拷贝的靶序列 PCR必需具备的基本条件是：必需具备的基本条件是：1、模板（、模板（DNA或或RNA）102-105拷贝的靶序列；拷贝的靶序列；2、人工合成寡核苷酸引物；、人工合成寡核苷酸引物；3、缓冲体系；、缓冲体系；4、Mg2+；5、dNTP；6、Taq酶；酶；7、温度循环参数（变性、复性、延伸温度及循环数；、温度循环参数（变性、复性、延伸温度及循环数；8、其他因素如加、其他因素如加BSA、DTT、矿物油等等，下面我们分、矿物油等等，下面我们分别讨论这些反应条件对别讨论这些反应条件对PCR影响。影响。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体

32、外扩增（一）模板核酸（一）模板核酸 前面三，我们已提到模板据前面三，我们已提到模板据PCR扩增对象及各学科专业知识而定，模板可以扩增对象及各学科专业知识而定，模板可以DNA需先逆转录需先逆转录cDNA才能进行正常才能进行正常PCR循环。循环。1、不同来源模板、不同来源模板DNA或或RNA制备请参考实验技术书。制备请参考实验技术书。2、模板核酸纯化的要求，尽可能纯化，不含、模板核酸纯化的要求，尽可能纯化，不含DNA酶聚合抑制剂，参考实验技酶聚合抑制剂，参考实验技术书籍。术书籍。3、模板核酸在、模板核酸在PCR反应中加入的量，一般为反应中加入的量，一般为102-105拷贝的靶序列，下述参数拷贝的靶

33、序列，下述参数供您参考：供您参考：1g人基因组人基因组DNA相当于相当于3105个单拷贝靶分子个单拷贝靶分子 10ng酵母酵母 DNA相当于相当于3105个单拷贝靶分子个单拷贝靶分子 1ng大肠杆菌大肠杆菌DNA相当于相当于3105个单拷贝靶分子个单拷贝靶分子 1%M13噬菌体人基因组噬菌体人基因组DNA相当于相当于106个单拷贝靶分子个单拷贝靶分子 扩增不同拷贝数的靶序列时，加入含靶序列的扩增不同拷贝数的靶序列时，加入含靶序列的DNA量亦不同，如：量亦不同，如：真核真核rRNA基因有基因有200-500拷贝，反应中仅需加入拷贝，反应中仅需加入0.5-2ng人基因组人基因组DNA即可。即可。以

34、质粒以质粒DNA与以染色体与以染色体DNA为模板扩增最适条件是不同的。前者所需量少，为模板扩增最适条件是不同的。前者所需量少，循环少，温度不如染色体循环少，温度不如染色体DNA要求严格。扩增染色体要求严格。扩增染色体DNA至少需要至少需要25-30个循环，个循环，如在第如在第15循环后补加一些循环后补加一些Taq酶获得更好的扩增效果。酶获得更好的扩增效果。扩增靶序的长度根据不用目的而不同。用于检测目的扩增片段长度一般为扩增靶序的长度根据不用目的而不同。用于检测目的扩增片段长度一般为500bp以内，以以内，以100-300bp为最好。用为最好。用Taq聚合酶在合适条件（较长延伸时间）下，聚合酶在

35、合适条件（较长延伸时间）下，可扩增长达可扩增长达10-20kb的片段。的片段。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（二）引物（二）引物 PCR扩增产物的大小是由特异引物限定的，因此引物的设计与合成对扩增产物的大小是由特异引物限定的，因此引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。的成功与否有着决定性的意义。1、引物合成的质量、引物合成的质量 合成引物须合成引物须PAGE和和HPLC纯化，因为合成引物中含有相当数量纯化，因为合成引物中含有相当数量“错误序列错误序列”其其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测的碱基修饰的完整链和高分子量产物。中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测的

36、碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异性扩增和信号强度的降低。因此，这些序列可导致非特异性扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高、所用引物质量要高、且需纯化。冻干引物且需纯化。冻干引物-20至少保存至少保存12-24个月，液体状态个月，液体状态-20可保存可保存6个月。引物个月。引物不用时应不用时应-20保存。保存。2、引物的设计原则、引物的设计原则 参前述二、逆循基本原则、借助微机帮助有助于参前述二、逆循基本原则、借助微机帮助有助于PCR成功。成功。3、引物的用量及其计算、引物的用量及其计算 一般一般PCR反应物终浓度为反应物终浓度为0.2-1mol/L（讲义（讲义

37、P217为为0.1-0.5mol/L）在此范围）在此范围内，内，PCR产物量基本相同。但引物低于产物量基本相同。但引物低于0.2mol/L时，则产物量偏低。过高会促进时，则产物量偏低。过高会促进引物引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体形成，二者与靶序列竞争引物引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体形成，二者与靶序列竞争DNA聚合聚合酶，酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。（引物浓度可按下述公式计算：摩底物，从而使靶序列的扩增量降低。（引物浓度可按下述公式计算：摩尔淬灭系数（尔淬灭系数（Em）是）是1cm光程比色杯中测定光程比色杯中测定1mol/L寡核苷酸溶液在寡核苷酸溶液在UV260

38、nm下的下的光密度（光密度（OD）值。）值。Em=a（16000）+b（12000）+c（7000）+d（9600）abcd代表寡核苷酸中代表寡核苷酸中A、G、T、C的个数。的个数。例：一纯化的例：一纯化的20mer寡核苷酸溶于寡核苷酸溶于0.1ml水中，取水中，取10l稀释至稀释至1.0ml，测其，测其OD为为0.76，原液，原液OD为为76，若，若AGTC均为均为5，代入公式，代入公式Em为为223000，76/223000=340nmol/L第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（三）耐热（三）耐热DNA聚合酶聚合酶 自从耐热自从耐热Taq酶引入酶引入PCR后，又有许多耐热后，又有许多

39、耐热DNA聚合酶（聚合酶（VENT和和Tth等）用等）用于于PCR、以、以Taq酶（酶（PE-cetus公司）多用。该酶公司）多用。该酶75-80时具有最高生物活性，温时具有最高生物活性，温度过低，过高，酶活性下降。后者还与引物度过低，过高，酶活性下降。后者还与引物-模板稳定性有关。在模板稳定性有关。在92.5，95，97，其活性半衰期分别为，其活性半衰期分别为130min、40min、5min具有良好的热稳定性。具有良好的热稳定性。100l反应体系中加入反应体系中加入0.5-5单位单位Taq酶，过高，琼脂糖凝胶电泳会出现非特异酶，过高，琼脂糖凝胶电泳会出现非特异扩增带，过低，靶序列产量低。扩

40、增带，过低，靶序列产量低。PCR后可通过后可通过1、99-100加热加热10min；或；或2、加入、加入EDTANAa2至至10mmol/L螯合螯合Mg2+；或；或3、酚、氯仿抽提，乙醇沉淀、酚、氯仿抽提，乙醇沉淀PCR产物灭活产物灭活Taq酶。酶。Taq酶有酶有53,而无而无3 5外切酶活性，因此它不具有大肠杆菌外切酶活性，因此它不具有大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow酶的酶的3 5“校对活性校对活性”，它的忠实性较后者差。，它的忠实性较后者差。（DDDPI-分子量分子量109KD，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解成两个片段，一个，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解成两个片段，一个片段为片段为7

41、6KD，有聚合酶，有聚合酶，3 5外切酶活性，即外切酶活性，即Klenow片段，另一为片段，另一为34KD，有，有53外切酶活性。聚合作用外切酶活性。聚合作用-以以DNA为模板，将为模板，将dNTP逐一按碱基配对原则加在逐一按碱基配对原则加在引物引物3-OH末端；末端；3 5外切酶活性外切酶活性-能识别清除错配的引物末端，有校正功能；能识别清除错配的引物末端，有校正功能；53-从从5切除切除DNA链，产生链，产生5单核苷酸，可能参入切除单核苷酸，可能参入切除RNA引物，跳过几个引物，跳过几个核苷酸切除错配核苷酸，在核苷酸切除错配核苷酸，在DNA损伤修复中起作用）。（缺口平移标记损伤修复中起作用

42、）。（缺口平移标记32PDNA探探针针DNA酶酶I）。）。PCR产物整体用作探针或直接测序，偶然错配则无关紧要。假若需要克隆单产物整体用作探针或直接测序，偶然错配则无关紧要。假若需要克隆单个个DNA分子（如突变分子（如突变DNA分子），则需要来自至少两个独立扩增系统或进行确证分子），则需要来自至少两个独立扩增系统或进行确证性测序加以印证。性测序加以印证。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（四）镁离子浓度（四）镁离子浓度 Mg2+是是TaqDNA聚合酶活性所必须的。聚合酶活性所必须的。Mg2+浓度除影响浓度除影响酶活性和忠实性外，也影响引物退火，模板与酶活性和忠实性外，也影响引物退火，模板

43、与PCR产物的解产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体形成等，过低，酶活力链温度，产物的特异性，引物二聚体形成等，过低，酶活力降低，过高，酶催化非特异性扩增。降低，过高，酶催化非特异性扩增。酶需要的是游离的酶需要的是游离的Mg2+浓度，浓度，PCR模板模板DNA原液中如含原液中如含EDTA螯合剂，引物和螯合剂，引物和dNTP的磷酸根均可与的磷酸根均可与Mg2+结合降低结合降低Mg2+浓度。最好对每种模板，每种引物组合都要进行浓度。最好对每种模板，每种引物组合都要进行Mg2+浓浓度优化，办法是：实验中模板、引物、度优化，办法是：实验中模板、引物、dNTP，设定循环参数，设定循环参数，Tris-

44、cl和和Kcl相对固定，相对固定，Mg2+以以0.5mmol/L开始以开始以0.5mmol/L浓度递增，电泳浓度递增，电泳EB染色确定各扩增产物量，确定染色确定各扩增产物量，确定Mg2+的最佳的最佳浓度。浓度。Mg2+浓度一般为浓度一般为0.5-2.5mmol/L之间，常用之间，常用1.5mmol/L（对应（对应dNTP浓度为浓度为200mol/L左右）左右）第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（五）（五）dNTPs（六）缓冲液（六）缓冲液 储备储备dNTP液具有较强的酸性，应以液具有较强的酸性，应以NaOH将将PH调至调至7.0-7.5，分装分装-20保存，避免过多冻融会使保存，避免过多

45、冻融会使dNTP降解。其浓度为降解。其浓度为20-200mol/L，高，增加错误掺入率，加快反应，低，提高实验精确，高，增加错误掺入率，加快反应，低，提高实验精确性，使反应速度下降。性，使反应速度下降。目前最为常用的缓冲液组成为目前最为常用的缓冲液组成为10-50 mmol/Ltris-Hcl（PH8.3室室温，温，72PH7.2），），50mmol/LKcl,1.5mmol/LMgcl2。Tris是双极性是双极性离子缓冲液，离子缓冲液，20Pka8.3，在实际，在实际PCR变化在变化在6.8-7.8之间，加大之间，加大Tris浓度（如至浓度（如至50mmol/L），改变反应液缓冲能力（），改

46、变反应液缓冲能力（PH8.9），有），有时会增加产量。时会增加产量。50mmol/L以内以内Kcl有利于引物退火，大于此浓度则有利于引物退火，大于此浓度则抑制酶活性，加入抑制酶活性，加入BSA、DTT（明胶或（明胶或Tween20）有助于酶稳定。）有助于酶稳定。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（七）温度循环参数（七）温度循环参数 1、变性温度和时间、变性温度和时间 一般一般94-9530-60s可使各种复杂可使各种复杂DNA分子完全变性（变性不完全会导致分子完全变性（变性不完全会导致PCR失败），过高，时常会影响失败），过高，时常会影响Taq酶活性，简单办法先变性，如酶活性，简单办法先

47、变性，如977-10min，再加酶，过低过短时间，变性不完全。再加酶，过低过短时间，变性不完全。2、复性（退火）温度与时间、复性（退火）温度与时间 复性温度决定复性温度决定PCR的特异性，一般为的特异性，一般为45-55，低，易退火，但特异性低；高，低，易退火，但特异性低；高，退火较难，但特异性高。引物复性温度和时间取决于引物碱基组成，长度。扩增退火较难，但特异性高。引物复性温度和时间取决于引物碱基组成，长度。扩增引物在引物在PCR条件下真实条件下真实Tm值值-5是合适的复性温度，是合适的复性温度，Tm=4（G+C）+2（A+T）（Tm-A260达到最大值达到最大值1/2，即变性，即变性DNA

48、达到达到DNA总量总量1/2时的温度）。退火时间时的温度）。退火时间30s足以使引物和模板结合足以使引物和模板结合 3、延伸温度与时间、延伸温度与时间 引物延伸温度一般为引物延伸温度一般为72，不适合温度会影响产物特异性及产物。延伸时核，不适合温度会影响产物特异性及产物。延伸时核苷酸掺入速度取决于缓冲体系，苷酸掺入速度取决于缓冲体系，PH，盐浓度和，盐浓度和DNA模板性质。延伸时间取决于靶模板性质。延伸时间取决于靶序列的长度和浓度，序列的长度和浓度，721min对于长达对于长达2kb的扩增片段是足够的，的扩增片段是足够的，3-4kb需要需要3-4min，时间过长会导致非特异性扩增带，对很低浓度

49、底物，时间要长些。，时间过长会导致非特异性扩增带，对很低浓度底物，时间要长些。4、循环数、循环数 不管模板浓度多少不管模板浓度多少25-30次循环是比较合理次数，因次循环是比较合理次数，因20-25次循环，次循环，PCR产物产物积累可达最大值，每次虽不能不能达到积累可达最大值，每次虽不能不能达到100%，但，但25-30次应该足够了。次应该足够了。第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增六、六、PCR实验中应注意的事项实验中应注意的事项（一）防止污染（一）防止污染 由于由于PCR强大扩增能力与检测敏感性，极微量污染便强大扩增能力与检测敏感性，极微量污染便可导致假阳性结果，采取如下措施，有助于防

50、止污染。可导致假阳性结果，采取如下措施，有助于防止污染。1、小量分装试剂。、小量分装试剂。2、使用一次性吸头及试管。、使用一次性吸头及试管。3、分开样品制备，、分开样品制备，PCR，PCR产物分析操作区。产物分析操作区。4、样品制备按无菌操作进行，避免样品间交叉污染。、样品制备按无菌操作进行，避免样品间交叉污染。5、使用专用微量可调加样器用于、使用专用微量可调加样器用于PCR。（带一次性手套）（带一次性手套）第十一章核酸体外扩增第十一章核酸体外扩增（二）实验中的对照（二）实验中的对照 每次实验都要设置严格对照，（以监测或追踪污染源每次实验都要设置严格对照，（以监测或追踪污染源和判断实验结果等）