第九讲基因操作的工具酶优质课件.ppt

1、第九讲基因操作的工具酶 主要用途转录mRNA成为cDNA制备基因片段C G T T A C G A A T C G G T A第二章 基因操作的工具酶用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍5-A GATC T-3具5 3聚合酶活性和3 5外切酶活性T4 DNA连接酶应用更广泛一些通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶53聚合酶活性（+）限制性核酸内切酶EcoR I及为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？3-C CTAG G-5RNA酶A(牛胰)在cDNA合成中，第二链的合成功能催化去除DNA、RN

2、A、rNTP和dNTP上的5 端磷酸基团,从DNA片段上除去5磷酸以防自身连接多样性:限制酶有200多种 盐离子浓度Na，Mg2来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接形成重组DNA分子结果：黏性末端（包括平末端）连接起来能在DNA上相同的位置切割用于基因分析及表达的众多技术的基础功能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5 端磷酸基团,从DNA片段上除去5磷酸以防自身连接多样性:限制酶有200多种酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10，否则甘油浓度过高，影响酶切反应EcoRGAATTC小片段53 DNA外切酶活性产生相同序列突出末端的三种方式专一性:

3、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子3 5 外切酶活性（-）G C A A G C T T T A G C C A T5-C TGCA G-3 5-CTGCAp OHG-3但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16过夜5到3DNA聚合酶活性 53 DNA外切酶活性主要用途转录mRNA成为cDNA制备基因片段大片段 53 DNA聚合酶活性 5粘性末端粘性末端5到3 DNA外切酶活性结果：黏性末端（包括平末端）连接起来简单的说:能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂

4、,产生相应的限制性DNA片段5-C TGCA G-3 5-CTGCAp OHG-32)大多数限制酶是错位切割双链DNA，产生5或3粘性末端商品化的限制性内切核酸酶均加50甘油作为保护剂，一般在20保存。在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接远距离裂解酶：识别位点与切割位置不一致由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故在平末端连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要求较高为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？如EcoR I的识别序列为T4 DNA连接酶应用更广泛一些EcoRGAATTC3-C TTAA G-5 EcoR I 3-CTTAAOH PG-5

5、决不能用水稀释,以免变性失活切除DNA片段上的单链末端，形成平末端标记DNA片段的末端等切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。逆转录酶又称RNA依赖的DNA聚合酶（RNAdependent DNA polymerase），存在于肿瘤病毒中由于具有相同的（如EcoR I）粘性末端，能退火形成双链结合体。5-CCC GGG-33-GGG CCC-5 标记DNA片段的末端等用途：DNA缺口平移中标记DNA探针名

6、 属 种 株 序 来源5-C TGCA G-3 5-CTGCAp OHG-3被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端这样MspI被用来识别所有的CCGG序列，而HpaII能用来确定是否甲基化为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？NAD+可促进该催化反应；直接用T4 DNA连接酶连接效率不高，较少采用在用P32磷酸和多核苷酸激酶在5端标记DNA或RNA之前，进行碱性磷酸酶处理；宿主细胞中甲基化的DNA位点被保护起来，不会被限制性核酸内切酶消化 反应时间通常为1h；细菌碱性磷酸酶（BAP）：E.有些限制酶来源不同、识别序列不同，但可产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶分子质量为60kd，单链多肽，最适pH为68根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，可将已发现的内切核酸酶分为三类：即I型、II型、III型酶简单的说:能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段