第八章基因工程与体外表达课件.ppt
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- 第八 基因工程 体外 表达 课件
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1、1 基因工程与体外表达基因工程与体外表达 Gene Engineering and Gene Expression 2 基因工程是指在体外对基因工程是指在体外对DNA分分子按照既定的目的和方案,对子按照既定的目的和方案,对DNA进进行剪切和重新连接,然后把它导入宿行剪切和重新连接,然后把它导入宿主细胞,从而能够扩增有关主细胞,从而能够扩增有关DNA片段,片段,表达有关基因产物,进行表达有关基因产物,进行DNA序列分序列分析,基因治疗,研究基因表达的调节析,基因治疗,研究基因表达的调节因子(如启动子、增强子等),以及因子(如启动子、增强子等),以及研究基因的功能等。研究基因的功能等。3 第一节第
2、一节 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶一、限制性核酸内切酶(一、限制性核酸内切酶(restriction enzyme)它是一种核酸内切酶,能从双链它是一种核酸内切酶,能从双链DNA内部内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。4 52限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名 EcoR E代表代表Escherichia属属 co代表代表coli 种种 R代表代表RY13株株63限制性内切酶的识别和切割位点限制性内切酶的识别和切割位点 通常是通常是46个碱基对、具有回文序个碱基对、具有回文序列(列(palindrom)的的DNA片段,大多数酶片段,大多数酶是错位切割双链
3、是错位切割双链DNA,产生产生5或或3粘性粘性末端(末端(sticky end)。)。如如EcoR切割后产生切割后产生5粘性末端:粘性末端:7Pst切割后产生切割后产生3粘性末端:粘性末端:有一些酶沿对称轴切断有一些酶沿对称轴切断DNA,产生平产生平端或钝端(端或钝端(Blunt end),如如Sma:8二、其他常用的工具酶二、其他常用的工具酶1.DNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase I)有聚合酶活性有聚合酶活性 有有35核酸外切酶活性核酸外切酶活性 有有53核酸外切酶活性核酸外切酶活性 91011122.DNA聚合酶聚合酶大片段大片段 DNA聚合酶聚合酶大片段大片段(large
4、fragment of DNA polymerase I)为为DNA聚合酶聚合酶I用枯草杆菌用枯草杆菌蛋白酶蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段,这个片裂解后产生的大片段,这个片段也称为段也称为Klenow片段(片段(Klenow fragment)。)。有有53聚合酶活性聚合酶活性有有35核酸外切酶活性核酸外切酶活性 无无53核酸外切酶活性核酸外切酶活性13Klenow片段的主要用途有:片段的主要用途有:(1)补齐双链补齐双链DNA的的3末端。末端。14(2)通过补齐通过补齐3端,使端,使3末端标记。末端标记。5-5-G-OH Klenow 5-GTTG-OH Klenow 5-
5、GTT*A A*A-OHA-OH 3-CAATT-OH d 3-CAATT-OH d*ATP,dTTP 3-CAAATP,dTTP 3-CAA T T T-OHT-OH(3)在在cDNA克隆中,第二股链的合成。克隆中,第二股链的合成。(4)DNA序列分析。序列分析。153.逆转录酶(逆转录酶(reverse transcriptase)是一种是一种RNA依赖的依赖的DNA聚合酶,即以聚合酶,即以RNA为模板合成为模板合成DNA,合成方向为合成方向为53延伸,无延伸,无35外切酶活性。外切酶活性。用于以用于以mRNA为模板合成为模板合成cDNA,构构建建cDNA文库。文库。16174.T4 DN
6、A连接酶(连接酶(T4 DNA ligase)T4 DNA连接酶催化双链连接酶催化双链DNA一端一端3-OH与另一双链与另一双链DNA的的5端磷酸根形成端磷酸根形成35磷酸二酯键,使具有相同粘性末端磷酸二酯键,使具有相同粘性末端或平端的或平端的DNA两端连接起来。两端连接起来。18195.碱性磷酸酶(碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)能去除能去除DNA或或RNA 5端的磷酸根。制端的磷酸根。制备载体时,用碱性磷酸酶处理后,可防止备载体时,用碱性磷酸酶处理后,可防止载体自身连接,提高重组效率。载体自身连接,提高重组效率。2021 6.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶
7、末端脱氧核苷酸转移酶(末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT),),简简称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到酸加到DNA的的3-OH上,主要用于探针上,主要用于探针标记;或者在载体和待克隆的片段上形标记;或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾,以便于进行连接。成同聚物尾,以便于进行连接。2223 第二节第二节 基因克隆的载体基因克隆的载体 质粒、噬菌体、粘粒、病毒载体质粒、噬菌体、粘粒、病毒载体24一、质粒(一、质粒(plasmid)质粒是存在于多数细菌和某些真核质粒是存在于多数细菌和某些真
8、核生物染色体外的双链环状的生物染色体外的双链环状的DNA分子。分子。质粒含有复制起始点,此复制起始点质粒含有复制起始点,此复制起始点与其他一些顺式调控因子构成复制子,能与其他一些顺式调控因子构成复制子,能利用细菌染色体利用细菌染色体DNA复制和转录的同一套复制和转录的同一套酶系统,在细菌体内独立地进行自我复制酶系统,在细菌体内独立地进行自我复制及转录。及转录。25作为克隆载体的质粒应具备下列特点:作为克隆载体的质粒应具备下列特点:(1)分子量相对较小,能在细菌内稳定存)分子量相对较小,能在细菌内稳定存在,有较高的拷贝数。在,有较高的拷贝数。(2)具有一个以上的遗传标志,便于对宿主)具有一个以上
9、的遗传标志,便于对宿主细胞进行选择,如抗生素的抗性基因,细胞进行选择,如抗生素的抗性基因,-半半乳糖苷酶基因(乳糖苷酶基因(Lac Z)等。等。(3)具有多个限制性内切酶的单一切点,便)具有多个限制性内切酶的单一切点,便于外源基因的插入。如果在这些位点有外源于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。而便于筛选。26272829 质粒一般只能容纳小于质粒一般只能容纳小于10kb的外源的外源DNA片段。片段。30二、二、噬菌体噬菌体 噬菌体噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌是感染细菌的病毒,
10、的病毒,用作克隆载体的噬菌体有两种:一种用作克隆载体的噬菌体有两种:一种是是噬菌体,另一种是噬菌体,另一种是M13噬菌体。噬菌体。野生型野生型噬菌体经过改造,已衍生出噬菌体经过改造,已衍生出100多多种克隆载体。种克隆载体。噬菌体载体分为插入型和替换噬菌体载体分为插入型和替换型型(置换型置换型)两类。两类。目前应用较广的是目前应用较广的是EMBL系列、系列、gt系列和系列和Charon系列等。系列等。31 32 gt10和和gt11载体适用于建立载体适用于建立cDNA文库。这文库。这两个载体都属插入型载体,能克隆两个载体都属插入型载体,能克隆7kb以下的外以下的外源源DNA。gt11为表达型载
11、体为表达型载体。33Ziplox载体载体34三、粘性质粒(三、粘性质粒(cosmid)粘性质粒是由粘性质粒是由噬菌体的噬菌体的粘性噬菌体的噬菌体的粘性末端(末端(cos区)与质粒重新构建的载体,为区)与质粒重新构建的载体,为双链、环状双链、环状DNA。其克隆容量可达其克隆容量可达4050kb。35四、四、M13噬菌体噬菌体 M13噬菌体(噬菌体(M13 phage)是一种是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体,全长约大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体,全长约6.5kb。M13感染细菌后,经过复制转变感染细菌后,经过复制转变为双链的复制型(为双链的复制型(RF)。)。复制型复制型M13可可用作克隆载体。用作克
12、隆载体。3637五、病毒载体五、病毒载体 逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化,病毒载体质粒主要由病载体均已质粒化,病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记,毒启动子、包装元件、选择性遗传标记,以及以及pBR322的复制子组成。的复制子组成。38 第三节第三节 基因克隆的基本过程基因克隆的基本过程 基因克隆主要分为以下几个步骤:基因克隆主要分为以下几个步骤:制备目的基因和相关载体;制备目的基因和相关载体;将目的基因和有关载体进行连接;将目的基因和有关载体进行连接;将重
13、组的将重组的DNA导入受体细胞;导入受体细胞;DNA重组体的筛选和鉴定;重组体的筛选和鉴定;DNA重组体的扩增、表达和其他研究。重组体的扩增、表达和其他研究。39一、一、目的基因的获得目的基因的获得(一)从基因组文库中获得(一)从基因组文库中获得 (二)从(二)从cDNA文库中获得文库中获得 (三)用聚合酶链反应(三)用聚合酶链反应(PCR)技术体外扩技术体外扩增有关增有关DNA片段片段(四)人工合成(四)人工合成40二二.载体的选择载体的选择41三、三、DNA分子的体外连接分子的体外连接(一)粘性末端(一)粘性末端(二)人工接头的使用(二)人工接头的使用(三)加入同聚体尾(三)加入同聚体尾(
14、四)平端连接(四)平端连接42(一)粘性末端(一)粘性末端4344定向克隆定向克隆45(二)人工接头(二)人工接头46(二)人工接头(二)人工接头47(三)加入同聚体尾48(四)平端连接(四)平端连接49四、外源四、外源DNA导入宿主细胞导入宿主细胞 将重组将重组DNA或其他外源或其他外源DNA导入宿导入宿主细胞,常用的方法有以下几种。主细胞,常用的方法有以下几种。(一)转化(一)转化(transformation)(二)感染(二)感染(infection)(三)转染(三)转染(transfection)50五、目的基因的筛选和鉴定五、目的基因的筛选和鉴定 将外源基因导入宿主细胞以后,首要将外
15、源基因导入宿主细胞以后,首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。等。51(一)(一)遗传学方法遗传学方法 1.抗生素筛选法抗生素筛选法(1)单抗生素筛选单抗生素筛选 大多数克隆载体带有抗生素抗性基因,如大多数克隆载体带有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素(氨苄青霉素(ampicillin,Amp)、)、四环素四环素(tetracycline,Tet)、卡那霉素卡那霉素(kanamycin,Kan)抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿
16、抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后,其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂主菌后,其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。平板上生长。52(2)双抗生素筛选)双抗生素筛选53双抗生素筛选结果示意图双抗生素筛选结果示意图542.蓝蓝-白筛选(白筛选(互补)互补)许多载体(如许多载体(如M13系列、系列、pUC系列、系列、pGEM系列)都含有系列)都含有-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和氨基端的调控序列和氨基端145个氨基酸的个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码位点。这种载体适用于可编码-半乳
17、糖苷酶半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性,但它们可以互补码的片段各自均无酶活性,但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为互补。互补。55 因此,当载体的多克隆位点没有插入外因此,当载体的多克隆位点没有插入外源源DNADNA片段时,片段时,互补能正常进行,产生有活互补能正常进行,产生有活性的性的-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。能使人工底物能使人工底物X-galX-gal变变成蓝色成蓝色,产生蓝色菌斑或菌落。如果载体的多产生蓝色菌斑或菌落。如果载体的多克隆位点插入了外源克隆位点插入
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