医科大学精品课件：质粒DNA的转化及筛选（7年制）.ppt

1、质粒质粒DNA的转化及筛选的转化及筛选 CaCl2法感受态制备法感受态制备 感受态感受态是指受体细胞处于容易吸收是指受体细胞处于容易吸收外源外源 DNA的一种生理状态，可以通过物理与化的一种生理状态，可以通过物理与化 学方法诱导形成学方法诱导形成。 实验步骤实验步骤 细菌感受态的制备：细菌感受态的制备： 1，Top10菌株培养过夜，以菌株培养过夜，以1:100比例接种培养比例接种培养3小时，冰小时，冰 浴浴30min，分装于，分装于EP管，管，2500rpm 4离心离心4min。 2,弃上清，沉淀弃上清，沉淀重悬重悬于于1ml预冷预冷0.1mol/LCaCl2 ，冰浴，冰浴 15min，250

2、0rpm 4 离心离心4min。 3，弃上清，沉淀弃上清，沉淀轻悬轻悬于于0.2ml预冷预冷0.1mol/L CaCl2 (此时细此时细 菌易破碎菌易破碎)，置冰浴。，置冰浴。 转化转化： 1，加入质粒加入质粒DNA 20 l，冰浴，冰浴30min。 2，42热冲击热冲击2min ，迅速冰浴，迅速冰浴2min。 3，加加1ml Amp LB培养基， 培养基，37振荡振荡 培养培养1小时小时（250rpm/min）。 + 20 基本原理：基本原理： 细菌处于细菌处于0的的CaCl2低渗溶液低渗溶液中，会膨胀成中，会膨胀成 球形，细胞膜的通透性发生变化球形，细胞膜的通透性发生变化 转化混合物中的质

3、粒转化混合物中的质粒DNA形成抗形成抗Dnase的羟的羟 基基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经过钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经过42短短 时间的热激动处理时间的热激动处理，促进细胞吸收复合物，促进细胞吸收复合物 在丰富的在丰富的无抗生素培养基无抗生素培养基上生长数小时后，上生长数小时后， 球状细胞复原并分裂增殖，在球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基选择培养基上可上可 获得所需的转化子获得所需的转化子。 蓝白筛法蓝白筛法 互 补 互 补 IPTG 载体质粒载体质粒DNA带有一个带有一个LacZ基因的调控序列基因的调控序列 和和头头146个氨基酸个氨基酸的编码信息，编码的编码信息，编码 -互补肽

4、，互补肽， 该肽段能与宿主编码的该肽段能与宿主编码的缺陷型缺陷型 -半乳糖苷酶实半乳糖苷酶实 现基因内互补（现基因内互补（ -互补互补）。）。 当这种载体转入可编码当这种载体转入可编码 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分端部分 序列的宿主细胞（序列的宿主细胞（Top10菌株）中时，在菌株）中时，在异丙异丙 基基- -D硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，的诱导下，宿主宿主 可同时合成这两种肽段，可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有虽然它们各自都没有 酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性 的蛋白质。所以称这种现象为的蛋白质。所以称这种现象为 -互补现象。互补现象。 Blue White Screening 筛选筛选 1，取取Amp+LB平板，用平板，用40 l -gal (20mg/ml)、4 l IPTG(200mg/ml)均匀涂均匀涂 于平板上。于平板上。 2，取取20-50 l细菌细菌培养产物涂培养产物涂Amp+平板。平板。 3，倒置平板，倒置平板，37培养培养过过夜，观察蓝白夜，观察蓝白 菌菌落落。