医科大学精品课件：质粒DNA的提取和鉴定(2).ppt

1、一，质粒一，质粒DNA的提取的提取 二，基因组二，基因组DNA的提取的提取 限制性内切酶酶切分析限制性内切酶酶切分析 三，三，DNA片段的连接与转化片段的连接与转化 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定 凝胶中凝胶中DNA的回收的回收 四，四，RNA的分离纯化的分离纯化 逆转录逆转录PCR 1，质粒，质粒DNA的的提取提取 2，基因组，基因组DNA的的提取提取 3， 限制性内切酶限制性内切酶酶切酶切分析分析 4，DNA片段的片段的连接连接接与转化接与转化 载体，外源载体，外源DNA片段，工具酶，片段，工具酶， 受体细胞受体细胞 质粒质粒DNA的提取及鉴定的提取及鉴定 生物化学与分子生物学系生物

2、化学与分子生物学系 实验目的实验目的 掌握质粒掌握质粒DNA制备的原理和方法制备的原理和方法 了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离 Bacterial DNA Plasmids 质粒质粒 质粒主要发现于细菌、放线菌和真 菌细胞中，独立于染色体之外的、 能自主复制的双链环状脱氧核糖核 酸物质。 基本思路基本思路 1. 1. 培养细菌使质粒扩增；培养细菌使质粒扩增； 2. 2. 收集和收集和裂解细菌裂解细菌； 3. 3. 分离质粒分离质粒DNADNA 4. 4. 电泳检测；电泳检测； 实验流程实验流程 细菌于细菌于LB培养基中培养过夜，分装（培养基中培养过夜，分装（1ml/ 支），

3、支），4000rpm离心离心2min，弃上清。，弃上清。 沉淀重悬于沉淀重悬于100 l溶液溶液中中, 震荡震荡混匀。混匀。 加入加入200 l新鲜配制新鲜配制的溶液的溶液，颠倒颠倒混匀，混匀， 不要震荡！（此步骤时间不宜过长）不要震荡！（此步骤时间不宜过长） 加入加入150 l溶液溶液，颠倒颠倒混匀，冰浴混匀，冰浴5min， 12000rpm离心离心10min。 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入等体积饱和等体积饱和 酚酚（约（约450 l），颠倒混匀，），颠倒混匀，12000rpm 离心离心 10min。 实验流程实验流程 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加

4、入管中，加入等体积酚等体积酚/氯氯 仿仿，颠倒颠倒混匀，混匀，12000rpm离心离心10min。 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入2倍体积冷无倍体积冷无 水乙醇水乙醇混匀，静置混匀，静置5min，12000rpm离心离心10min。 弃上清，用弃上清，用0.5ml 70% 乙醇，乙醇，12000rpm离心离心 5min，弃上清，倒置干燥。，弃上清，倒置干燥。 加入加入10 l TE，1%琼脂糖凝胶电泳观察。琼脂糖凝胶电泳观察。 TE 10ul 6x loading buffer 2ul DNA染料 1ul 碱裂解法实验原理碱裂解法实验原理 细菌悬浮液暴露于细菌悬浮液暴

5、露于NaOH 、SDS 细胞壁破裂，染色体细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性和蛋白质变性 相互缠绕成复合物被相互缠绕成复合物被SDS包裹，当用包裹，当用K+取代取代 Na+时，复合物从溶液中沉淀下来。时，复合物从溶液中沉淀下来。 离心后可从上清中回收质粒离心后可从上清中回收质粒DNA LBLB液体培养基液体培养基 称取蛋白胨称取蛋白胨10g10g，酵母提取物，酵母提取物5g5g，NaCl 10gNaCl 10g，溶于，溶于800ml800ml 去离子水中，用去离子水中，用NaOHNaOH调调pHpH至至7.57.5，加去离子水至总体，加去离子水至总体 积积1 1升，高压下蒸气灭菌升，高压下蒸

6、气灭菌2020分钟。分钟。 试试 剂剂 溶液溶液：50 mmol/L葡萄糖、葡萄糖、10mmol/L EDTA、2 5mmol Tris-HCl pH8.0 溶液溶液I：重悬细菌；：重悬细菌； 葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀； TrisHCl：缓冲体系；：缓冲体系； EDTA：螯合金属离子；：螯合金属离子； 溶液溶液II（新鲜配制）（新鲜配制）: 1mol/L NaOH 200 l、 10% SDS 100 l、H2O 700 l 溶液溶液II破膜，变性基因组破膜，变性基因组DNA和蛋白质；和蛋白质； SDS破膜作用，变性蛋白质；破膜作用，变性蛋白质； NaOH

7、破膜，变性基因组破膜，变性基因组DNA 溶液溶液 III : 29.4g KAc、11.5ml冰醋酸、加水至冰醋酸、加水至 100ml 溶液溶液III中和溶液，复性质粒中和溶液，复性质粒DNA 酚酚/ /氯仿（氯仿（1:11:1） 分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。 吸取时不要震荡。吸取时不要震荡。 酚酚变性蛋白质；变性蛋白质； 氯仿氯仿萃取溶液中的酚；萃取溶液中的酚； 乙醇乙醇 无水乙醇（无水乙醇（2 2倍体积）倍体积）沉淀质粒沉淀质粒DNADNA； 70%70%乙醇乙醇洗涤质粒洗涤质粒DNADNA沉淀，除去沉沉淀，除去沉 淀中的盐分；淀中的

8、盐分； 染料染料EBEB 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）是一种荧光染料，）是一种荧光染料， 其分子可以嵌入到核酸的碱基对之其分子可以嵌入到核酸的碱基对之 间，在紫外线的激发下，发出橙色间，在紫外线的激发下，发出橙色 荧光。荧光。 核酸的定量核酸的定量 260 nm， 1OD值相当于：值相当于： 双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml 单链单链DNA浓度为浓度为40 g/ml A260/A280 = 1.8（DNA） A260/A280 = 2.0（RNA） 电泳鉴定电泳鉴定 其中其中超螺旋结构超螺旋结构泳动最快；泳动最快； 其次为其次为开环结构开环结构； 最慢的可能是最慢的可能是复制中间体复制中间体（没有复制完（没有复制完 的两个质粒连在一起）；的两个质粒连在一起）；