医科大学精品课件:小鼠肝组织RNA提取及RT-PCR实验 (2).ppt
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- 医科大学精品课件:小鼠肝组织RNA提取及RT-PCR实验 2 医科大学 精品 课件 小鼠 组织 RNA 提取 RT PCR 实验
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1、小鼠肝组织小鼠肝组织RNA提取及提取及 RT-PCR 一、试剂及材料一、试剂及材料 1、小鼠肝脏、小鼠肝脏 2、DEPC(焦碳酸二乙酯)焦碳酸二乙酯)处理过的处理过的EP管、管、 PCR管管 3、 Trizol 、氯仿、异丙醇、氯仿、异丙醇、DEPC水水 异硫氰酸胍异硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 TRIzolTRIzol的主要成分是的主要成分是苯酚苯酚。苯酚的主要作用是裂。苯酚的主要作用是裂 解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释 放。放。 TRIzolTRIzol中加入了中加入了8 8羟基喹啉、异硫氰酸胍、羟基喹啉、异硫氰酸胍、- - 巯基乙醇等来
2、抑制内源和外源巯基乙醇等来抑制内源和外源RnaseRnase 异异硫氰酸胍硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变 性剂,可使核蛋白迅速与核酸分离。性剂,可使核蛋白迅速与核酸分离。 释放出来的释放出来的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不下溶解度的不 同而分别位于整个体系中的中间相和水相,从而同而分别位于整个体系中的中间相和水相,从而 得以分离得以分离 二、实验原理二、实验原理 TRIZOL:异硫氰酸胍:异硫氰酸胍 + 苯酚(苯酚(PH5) 裂解细胞,RNA与蛋 白质分离,将RNA释 放到溶液中。 促使RNA进入水相, 离心后可形
3、成水相 层和有机层。 RNA与仍留在有机相中的蛋白质和与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。分离开。 水相层(无色)主要为水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色),有机层(黄色) 主要为主要为DNA和蛋白质和蛋白质。 基因组基因组DNA 水相 有机相 RNA pH5.7 三、实验步骤三、实验步骤 RNA提取提取 1、新鲜肝组织置、新鲜肝组织置EP管中,加管中,加200 l Trizol充分充分研磨后,补研磨后,补 加加800 l Trizol,枪头吹匀。,枪头吹匀。 2、加入、加入200 l 氯仿,氯仿,剧烈震荡剧烈震荡15秒,秒,4 12000g离心离心 15min。 3、将上层水相移至
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