医科大学精品课件：小鼠肝组织RNA提取及RT-PCR实验 (2).ppt

1、小鼠肝组织小鼠肝组织RNA提取及提取及 RT-PCR 一、试剂及材料一、试剂及材料 1、小鼠肝脏、小鼠肝脏 2、DEPC（焦碳酸二乙酯）焦碳酸二乙酯）处理过的处理过的EP管、管、 PCR管管 3、 Trizol 、氯仿、异丙醇、氯仿、异丙醇、DEPC水水 异硫氰酸胍异硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 TRIzolTRIzol的主要成分是的主要成分是苯酚苯酚。苯酚的主要作用是裂。苯酚的主要作用是裂 解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释 放。放。 TRIzolTRIzol中加入了中加入了8 8羟基喹啉、异硫氰酸胍、羟基喹啉、异硫氰酸胍、- - 巯基乙醇等来

2、抑制内源和外源巯基乙醇等来抑制内源和外源RnaseRnase 异异硫氰酸胍硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变 性剂，可使核蛋白迅速与核酸分离。性剂，可使核蛋白迅速与核酸分离。 释放出来的释放出来的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不下溶解度的不 同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而 得以分离得以分离 二、实验原理二、实验原理 TRIZOL：异硫氰酸胍：异硫氰酸胍 + 苯酚（苯酚（PH5） 裂解细胞，RNA与蛋 白质分离，将RNA释 放到溶液中。 促使RNA进入水相， 离心后可形

3、成水相 层和有机层。 RNA与仍留在有机相中的蛋白质和与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。分离开。 水相层（无色）主要为水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色），有机层（黄色） 主要为主要为DNA和蛋白质和蛋白质。 基因组基因组DNA 水相 有机相 RNA pH5.7 三、实验步骤三、实验步骤 RNA提取提取 1、新鲜肝组织置、新鲜肝组织置EP管中，加管中，加200 l Trizol充分充分研磨后，补研磨后，补 加加800 l Trizol，枪头吹匀。，枪头吹匀。 2、加入、加入200 l 氯仿，氯仿，剧烈震荡剧烈震荡15秒，秒，4 12000g离心离心 15min。 3、将上层水相移至

4、洁净、将上层水相移至洁净EP管中，加入管中，加入500 l异丙醇颠倒异丙醇颠倒 混匀。混匀。 4、4 12000g离心离心10min。 5、弃水相，、弃水相，EP管开盖干燥，溶于管开盖干燥，溶于50 l DEPC水中。水中。 RT-PCR：RNA的反转录的反转录 + cDNA的的PCR RT-PCR操作步骤操作步骤 5x Prime Script Buffer 2 l Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 l Oligo dT primer (50 m) 0.5 l Random 6 mers (100 m) 1 l 提取的提取的RNA 0.5 l RNase Free

5、 水水 5.5 l 37 15min 85 5 sec 10 l 反转录反应时反转录反应时Primer的选择的选择 反转录引物的选择，应结合实验的具体情况，反转录引物的选择，应结合实验的具体情况， 选择以下三种引物，即：选择以下三种引物，即：Random 6 mers、 Oligo dT Primer或特异性下游引物或特异性下游引物。对没有发。对没有发 夹结构的短链夹结构的短链mRNA，上述三种引物都可以使，上述三种引物都可以使 用。用。 Random 6 mers 适用于适用于长的或具有长的或具有Hairpin结构的结构的RNA。 包括包括rRNA、mRNA、tRNA等等所有所有RNA 的反

6、转录都可使用该引物。的反转录都可使用该引物。 Oligo dT Primer 适用于真核生物适用于真核生物具有具有Poly(A) 尾的尾的RNA。 特异性下游引物特异性下游引物 (PCR时的下游引时的下游引 物物) 必须与模板序列互补，需了解必须与模板序列互补，需了解Target序序 列。列。 PCR 10x PCR Buffer 5 l dNTP 4 l 模板模板DNA 2 l 引物引物1 2 l 引物引物2 2 l Taq 酶酶 0.5 l H2O 34.5 l 50 l 94 5 min 94 30 sec 54 30 sec 72 30 sec 72 7 min 25 cycle 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果琼脂糖凝胶电泳观察结果 D2000 mark 20l PCR产物 4l loading buffer 1l DNA染料