医科大学精品课件：实验三、酶Km值测定.ppt

1、 2 概念概念 研究各种因素对研究各种因素对酶促反应速度酶促反应速度的影响，并加以的影响，并加以 定量的阐述。定量的阐述。 影响因素包括有影响因素包括有 酶浓度、底物浓度、酶浓度、底物浓度、pHpH、温度、温度、 抑制剂、激活剂等。抑制剂、激活剂等。 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。 3 酶活性可以用在一定条件下所催化的酶活性可以用在一定条件下所催化的化学反应速化学反应速 度来表示。度来表示。 测定酶活力，实际上是测定酶促反应的速度。反测定酶活力，实际上是测定酶促反应的速度。反 应速度一般以在一定条件下应速度一般以在一定条件下单位时间底物的消耗单

2、位时间底物的消耗 量或产物的生成量量或产物的生成量来表示。来表示。 酶活性的表示酶活性的表示 4 底物浓度对反应速度影响底物浓度对反应速度影响 在其他因素不变在其他因素不变 的情况下，底物浓度的情况下，底物浓度 对反应速度的影响呈对反应速度的影响呈 矩形双曲线矩形双曲线关系。关系。 S V 5 SS： 底物浓度底物浓度 V V： 不同不同SS时的反应初速度时的反应初速度 V Vmax max：最大反应速度 ：最大反应速度(maximum velocity) (maximum velocity) m m：米氏常数：米氏常数(Michaelis constant)(Michaelis consta

3、nt) VmaxS Km + S Michaelis Menten Michaelis Menten 方程式方程式 6 Km值值 Km等于等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的酶促反应速度为最大反应速度一半时的 底物浓度底物浓度（单位是单位是mol/Lmol/L）。）。 生物学意义：生物学意义： a) Km是酶的是酶的特征性特征性常数之一；常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的可近似表示酶对底物的亲和力亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的同一酶对于不同底物有不同的Km值。值。 Km最小者为酶的最小者为酶的天然底物天然底物或最适底物。或最适底物。 7 K Km m的测定的测定 Km S

4、 2 Km + S Vmax VmaxS Vmax V S Km Vmax/2 KmKm的单位为底物浓度单位的单位为底物浓度单位 S S V V（A) A) 作图作图 A 8 VmaxS Km+S V = （林贝氏方程）（林贝氏方程） 两边同取倒数两边同取倒数 m m值与值与max max值的测定 值的测定 1/S 1/S - - 1/V (1/A1/V (1/A）作图）作图 (1/A） 1/S 9 碱性磷酸酶碱性磷酸酶AKPAKP活性测定活性测定 10 11 注意事项注意事项 1.1.底物和酶取样准确底物和酶取样准确 2.2.保温时间准确保温时间准确 1 2 3 4 5 6 7 加入酶的时加

5、入酶的时 间间 加入碱性溶液加入碱性溶液 终止反应的终止反应的 时间时间 9:00:00 9:01:00 9:03:00 9:04:00 9:05:00 9:06:00 9:02:00 9:15:00 9:16:00 9:17:00 9:18:00 9:19:00 9:20:00 9:21:00 保证每个试管的反应时间为保证每个试管的反应时间为1515分钟分钟 12 原始数据记录原始数据记录 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 A1A1 0.000 13 实验报告注意事项实验报告注意事项 1.1.原理原理 2.2.数据记录表格数据记录表格 3.3.绘制矩形双曲线图绘制矩形双曲线图 4.4.绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱性磷酸酶绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱性磷酸酶AKPAKP对磷酸苯二钠的对磷酸苯二钠的KmKm 值值 1 2 3 4 5 6 7 A S 1/A 1/S