医科大学精品课件：实验四、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH.ppt

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDHLDH 【实验原理实验原理】 电泳概述及原理电泳概述及原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色原理乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色原理 一、概述一、概述 1 1、电泳概念：、电泳概念： 带电粒子在电场中向着与其本身带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电荷相反的 电极移动电极移动的过程。的过程。 2 2、电泳技术优点：、电泳技术优点： 快速、准确、重现性好快速、准确、重现性好 3 3、电泳方法分类、电泳方法分类 4 4、电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带、电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带 电泳）

2、、电场（电泳仪、电泳槽）电泳）、电场（电泳仪、电泳槽） 电泳概述及原理电泳概述及原理 二、电泳的基本原理二、电泳的基本原理 迁移率：迁移率：带电颗粒在单位电场强度下的移动带电颗粒在单位电场强度下的移动 速度。速度。 m m v/E=(d/t)/(V/L)=(dL)/Vtv/E=(d/t)/(V/L)=(dL)/Vt 影响电泳的因素：影响电泳的因素： 1 1、颗粒本身：带电量、大小、形状、颗粒本身：带电量、大小、形状 2 2、外界因素：电场强度、外界因素：电场强度E E、pHpH、离子强度、离子强度I I、电、电 渗、缓冲液粘度及温度等。渗、缓冲液粘度及温度等。 1 1、带电颗粒的物理性状、带电

3、颗粒的物理性状 包括带电颗粒电荷数，颗粒大小、形状和包括带电颗粒电荷数，颗粒大小、形状和 空间构型。空间构型。 QQ，v v ；r r ，vv。 2 2支持物介质支持物介质 支持物的多孔结构支持物的多孔结构电渗作用电渗作用 多孔支持物表面可吸附电极溶液中的正多孔支持物表面可吸附电极溶液中的正 离子或负离子使靠近支持物的溶液层相对带离子或负离子使靠近支持物的溶液层相对带 电，在电场作用下，溶液就会向一定方向移电，在电场作用下，溶液就会向一定方向移 动。动。 凝胶支持物结构的孔隙对带电颗粒分子产生凝胶支持物结构的孔隙对带电颗粒分子产生 阻力。阻力。 3 3缓冲溶液：缓冲溶液： pHpH值：溶液的值

4、：溶液的pHpH值决定带电颗粒的解离程度，值决定带电颗粒的解离程度， 亦即决定亦即决定Q Q。 离子强度：一般最适的离子强度在离子强度：一般最适的离子强度在0.020.020.20.2 之间之间，溶液的离子强度越高，则电泳速度越慢。，溶液的离子强度越高，则电泳速度越慢。 溶液粘度：迁移率与溶液粘度呈反比关系。溶液粘度：迁移率与溶液粘度呈反比关系。 4 4电场强度（电场强度（E E）：）： 电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降，电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降， 也称电势梯度。也称电势梯度。 EE，v v 聚丙烯酰胺凝胶的性能聚丙烯酰胺凝胶的性能 聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶的制备 聚

5、丙烯酰胺凝胶电泳的原理聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 【聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）】 一、聚丙烯酰胺凝胶的性能一、聚丙烯酰胺凝胶的性能 特性：特性： 机械强度好，有弹性，透明，相对化学稳定，机械强度好，有弹性，透明，相对化学稳定， 对对pHpH和温度变化较稳定，没有吸附和电渗作用。和温度变化较稳定，没有吸附和电渗作用。 调节单体的浓度和交联度可以控制孔径大小。调节单体的浓度和交联度可以控制孔径大小。 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，能分离、小量制备聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，能分离、小量制备 生物大分子，而且可用来研究生物大分子的性生物大分子，而且可用来研究生物大分子的性 质如电

6、荷、相对分子质量、等电点以及构象等。质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。 丙烯酰胺（丙烯酰胺（AcrAcr，单体，单体）N,NN,N- -甲叉双丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺 （ BisBis，交联剂，交联剂）（催化剂）（催化剂）聚合聚合 催化剂：催化剂： （1 1）过硫酸铵过硫酸铵四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMEDTEMED） （2 2）核黄素（）核黄素（VitBVitB2 2）光）光 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单 体浓度。体浓度。 二、聚丙烯酰胺凝胶的制备二、聚丙烯酰胺凝胶的制备 【凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响凝胶总浓度及交联度对凝胶

7、的影响】 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包 括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。 T T为凝胶总浓度，为凝胶总浓度，C C为交联度。为交联度。 a为丙烯酰胺单体的质量为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积为溶液的终体积(mL)。 凝胶凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于小于10时，凝胶脆且硬，时，凝胶脆且硬， 不透明，呈乳白色；当

8、不透明，呈乳白色；当a:b大于大于100时，即使用时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈的丙烯酰胺凝胶也呈 糊状；通常用糊状；通常用a:b在在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹，凝胶富有弹 性并且透明。性并且透明。 %100 m ba T %100 ba b C 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理原理 四个不连续性四个不连续性：凝胶浓度凝胶浓度的不连续性；的不连续性；缓冲液离子成分缓冲液离子成分的不的不 连续性；缓冲液连续性；缓冲液pHpH梯度梯度的不连续性；的不连续性；电位梯度电位梯度的不连续性。的不连续性。 三个效应：三个效应：浓缩效应、分

9、子筛效应与电荷效应浓缩效应、分子筛效应与电荷效应 1. 1. 浓缩效应浓缩效应 1 1）凝胶层的不连续性）凝胶层的不连续性 两层凝胶两层凝胶T T与与C C不同不同 孔径不同孔径不同 浓缩胶：大孔径浓缩胶：大孔径 分离胶：小孔径分离胶：小孔径 2 2）缓冲液离子成分的不连续性）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸甘氨酸 （pI=6.0pI=6.0）在）在pH8.3pH8.3带负电，朝正极移动，带负电，朝正极移动， 进入浓缩胶（进入浓缩胶（pH6.7pH6.7），甘氨酸解离度（），甘氨酸解离度（ ）很小，）很小， 有效迁移率（有效迁移率（M M ）很低，移动速度较慢，称为）很低，移动速度较慢，称为

10、慢离子慢离子。 HClHCl 强电解质，强电解质， =1=1，ClCl- -有效迁移率大，移动速度有效迁移率大，移动速度 快，称快，称快离子快离子。 蛋白质蛋白质（pIpI6.06.0）带负电荷，）带负电荷，有效迁移率介于两者有效迁移率介于两者 之间。之间。 pH8.3 TrispH8.3 Tris- -甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液 甘氨酸甘氨酸 ClCl- - 蛋白质蛋白质 样品胶样品胶 浓缩胶浓缩胶 分离胶分离胶 样品样品 低 电 导 区 低 电 导 区 3 3）pHpH值的不连续性值的不连续性 为了控制慢离子的解离度为了控制慢离子的解离度，从而控制其从而控制其 有效迁移率有效迁移率，必须使浓

11、缩胶与分离胶之间必须使浓缩胶与分离胶之间pHpH值值 有所区别有所区别。 2 2. .分子筛效应与电荷效应分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后进入分离胶后，GlyGly- -成为快离子成为快离子 分离胶只有分离胶只有电荷效应和分子筛效应电荷效应和分子筛效应，根据各根据各 蛋白质所带电荷不同蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离分子大小不同而分离 19591959年年MarkertMarkert等用电泳的方法将纯化等用电泳的方法将纯化 的心肌乳酸脱氢酶的心肌乳酸脱氢酶(LDH)(LDH)分离出分离出5 5条区带，由条区带，由 阳极到阴极依次命名为阳极到阴极依次命名为LDHLDH1 1、LDHLDH

12、2 2、LDHLDH3 3、 LDHLDH4 4、LDHLDH5 5。 【LDHLDH聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳】 【乳酸脱氢酶同工酶染色乳酸脱氢酶同工酶染色】 将凝胶浸泡在活性染色液中，将凝胶浸泡在活性染色液中，LDHLDH与底物的反应与底物的反应 LDH4 LDH3 LDH5 LDH1 LDH2 1 2 3 4 【电泳结果实例电泳结果实例】 电泳装置电泳装置 采用Pharmacia公司的SE250小型夹 心式垂直板电泳装置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 【凝胶电泳的操作要点凝胶电泳的操作要点】 1 1、凝胶制备、凝胶制备 2 2、电极缓冲液、电极缓冲液 3 3、

13、样品处理及加样、样品处理及加样 4 4、电泳、电泳 5 5、染色、染色 试剂试剂 分离胶分离胶 浓缩胶浓缩胶 A A液液(ml)(ml) 1.81.8 B B液液(ml)(ml) 2.02.0 C C液液(ml)(ml) D D液液(ml)(ml) 0.70.7 1.41.4 蒸馏水蒸馏水(ml)(ml) 5.05.0 2.42.4 1% TEMED(ml)1% TEMED(ml) 0.50.5 0.20.2 1%1%过硫酸铵（过硫酸铵（mlml） 0.70.7 0.30.3 总体积总体积 10mL10mL 5.0mL5.0mL 胶浓度胶浓度 6%6% 3.5%3.5% 实验报告 一、原理一、原理 二、操作二、操作 三、结果三、结果