医科大学精品课件：生物化学和分子生物学实验（本科-集合）.ppt

1、第一节 分光光度法 (Spectrophotometry) 定义： 根据物质对光的吸收物质对光的吸收特性和吸收 强度，对物质进行定性和定量定性和定量的分析方 法。 溶液的颜色溶液的颜色实质实质是是它所吸收的色光的互补它所吸收的色光的互补 色色。如：日光照射。如：日光照射KMnO4，其中，其中绿光绿光被吸收，被吸收， 故溶液呈故溶液呈紫色紫色。CuSO4呈呈蓝色蓝色是由于溶液吸收是由于溶液吸收 了了黄光黄光。 溶液越浓，光选择吸收越多，颜色越深。溶液越浓，光选择吸收越多，颜色越深。 比较溶液颜色的深浅，比较溶液颜色的深浅，实质实质比较溶液对光比较溶液对光 的吸收程度的吸收程度。 溶液的颜色 【颜

2、色的秘密颜色的秘密】http:/zh.wikipedia.org/wiki/%E9%A2%9C%E8%89%B2 互补色 互补色光互补色光 如：黄光和蓝光；如：黄光和蓝光； 红光和绿光。红光和绿光。 Lambert-Beer定律定律 （Lambert Beers Law）: A=kCL 物质对光的吸收 To a specific wavelength, 光的吸收定律光的吸收定律 o t I I T A = -lgT =lg t o I I A=bc Lambert-Beer定律定律 透光率 吸光度 A=ab mol L-1 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 g L-1 质量吸光系数质量吸光系数 =aM

3、 例5-5 波长的选择 待测物质最大的吸收峰的波长； 在最大吸收峰的波长下测定的吸光值和溶液待测吸收 物质的浓度呈正比； Conc 光 光是一种电磁波。自然光是由波长（光是一种电磁波。自然光是由波长（ ） 不同的电磁波组成的混合光。不同的电磁波组成的混合光。 可见光 可见光，可见光， 在在400760nm范围。范围。 基本流程 单色光波长：5nm 四、定量分析法四、定量分析法 （一）标准曲线法（一）标准曲线法 根据Lambert-Beer定律，定律， A与与C成正比成正比 配制一系列标准液配制一系列标准液 C1、C2、C3， 在在 max下，测相应的下，测相应的A1、 A2、A3。 C / (

4、mol L-1) Ax Cx (二二)标准对照法标准对照法 配制与被测液（C样）相近浓度标准液（C标）， 在max分别测得A标、A样。 A样 A标 = C样 C标 A样 A标 =C样C标 CuSO4的含量测定 见表1-2-1 试剂 标准管 测定管 空白管 CuSO4标准液 1.0 CuSO4测定液 0.8 ddw 6.0 6.2 7.0 实验步骤 1.核对仪器，“多的”放在讲台右侧的台面上；“缺的” 到第二准备室领取； 2.参照p15，表1-2-1配置三个样品； 3.打开7220型分光光度计，预热10分钟； 4.调节波长旋钮，使显示窗显示所需波长值(700nm)； 5.按方式选择mode键使透

5、射比(T%)指示灯亮； 6.在样池架中放空白样品，按100%T键调100%； 7.在样池架中放挡光块，按0%T； 8.按mode,选择ABS档； 9.在样池架中放样品，测定吸光值； 10. 计算待测样品的浓度，请列好公式； 1h 注意引入的稀释度的差别：Ax/As=CxVx/CsVs CS*Vs= C标准 标准*Vs终终 Cx*Vx= C测定 测定*Vx终终 A标准 标准 A测定 测定 C标准 标准 C测定 测定 = A标准 标准 A测定 测定 = CS*Vx终 终*Vs Cx*Vs终 终*Vx A标准 标准 A测定 测定 = CS*Vs Cx*Vx = Cx A标准 标准 CS * Vs V

6、x A测定 测定 实验报告 一 原始记录 记录实验所获得的原始数据。 标准 测定 空白 A 0.00 原始记录需实验课结束教师签字原始记录需实验课结束教师签字 实验报告（正文） 实验目的 实验原理（用自己的语言，进行描述， 尽可能详尽） 实验结果（将原始数据进行整理，列表， 计算，注意表述清楚，包括单位等） 讨论（在实验中发现的问题，进行总结， 讨论） 第二节 蛋白质定量分析 蛋白质定量分析也就是蛋白质 溶液的浓度测定； 现实应用： 1. 临床检测血清蛋白浓度 测定； 2. 科学研究纯化蛋白的浓 度测定； 生化与分子生物学： 郑敏 （Min Zheng） Lambert-Beer定律定律 （L

7、ambert Beers Law）: A=kCL 物质对光的吸收 To a specific wavelength, 主要方法 根据蛋白质元素组成凯氏定氮法； 根据蛋白质组成特点建立的比色法双缩脲 法，lowry改良法，考马斯亮蓝染色法，BCA 法； 根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法； 凯氏定氮法 测定化合物或混合物中总氮量的一种方 法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸 消化样品将有机氮都转变成无机铵盐， 然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随 水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以 标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。 由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮 量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋 白

8、质定量方法。 BCA法 苹果绿苹果绿 紫色紫色 双缩脲法 一、实验原理双缩脲反应 OH- 蓝色蓝色 紫红色紫红色 在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比1-10mg； 蛋白质的双缩脲反应蛋白质的双缩脲反应 Cu2+ OH- 蓝色蓝色 紫红色紫红色 蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收 Tyr Trp 1. 蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸。蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸。 它们具有吸收紫外光的性质。它们具有吸收紫外光的性质。 2. 其最高吸收峰在其最高吸收峰在280nm波长处，且在此波长内波长处，且在此波长内 吸收峰的光密度值与其

9、浓度成正比。吸收峰的光密度值与其浓度成正比。 3. 由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同， 因而要有待测的蛋白质的标准品作比较，才能因而要有待测的蛋白质的标准品作比较，才能 进行准确定量。进行准确定量。 四、定量分析法四、定量分析法 （一）标准曲线法（一）标准曲线法 根据Lambert-Beer定律，定律， A与与C成正比成正比 配制一系列标准液配制一系列标准液 C1、C2、C3， 在在 max下，测相应的下，测相应的A1、 A2、A3。 C / (mol L-1) Ax Cx (二二) 标准对照法标准对照法 配制与被测液（C样）相近浓度标准液（C

10、标）， 在max分别测得A标、A样。 A样 A标 = C样 C标 A样 A标 =C样C标 实验步骤 1.如表1-2-2（p16） 注意事项：1. 移液管的使用和液体的量取； 2.混匀各管，在37度水浴保温20分钟； 3.在7220型分光光度计中调节波长为540nm； 4.用空白管调100%T； 5.用黑块调0%T； 6.读ABS 7.以吸光度（A）为纵坐标，以蛋白质浓度（g/L）为横坐标做标 准曲线； 8.求待测血清样品的蛋白质浓度； 9.取一管相近吸光度的标准管进行“标准对照法”求待测血清样 品的蛋白质浓度； 紫外吸收法测定 稀释待测样品，如表2-6-4。（p72） 将0.4ml待测样品和3

11、.6ml生理盐水混合。 在9220型分光光度计里分别在260nm和 280nm下，测定吸光值（注意用紫外分光 光度计专用的比色皿，侧面标有H）。 利用经验公式计算待测样品的含量。见 p73. 需签名的原始数据 原始数据 列表，做标准曲线（慢的同学的可省去）； 求Cx（未稀释的，注明标准曲线法和紫外吸收 法） 结论 什么溶液-什么溶质-XXX-什么单位 生物化学和分子生物学实验 必须穿白大褂； 书包放在实验台的上层架子上； 实验报告在实验课后一天内由课代统一上交； 值日生注意事项强调： 1. 清洁实验台上层架子； 2. 清洁比色皿； 3. 将所有移液枪调到最大量程； 第三节第三节 碱性磷酸酶碱性

12、磷酸酶Km值的测定值的测定 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 碱性磷酸酶(简称ALP或AKP)是广泛 分布于人体肝脏，骨骼，肠，肾和胎 盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶, 碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原 发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性 肝炎等的检查。 一般的成人的碱性磷酸酶正常值为 32-92U/L。 酶比活性定义酶比活性定义 国际酶学委员会规定，酶的比活性用每 毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。 因而，必须测定蛋白质毫克数和每毫升 样品中酶活性的单位数。 酶活性单位在37度下保温15分钟产 生1ug酚，为一个酶活性单位。 酶促反应动力学酶促反应动力学 研究酶促反应速率及影响因素研究酶促反应速率及影响

13、因素 底物浓度底物浓度 酶浓度酶浓度 pH 温度温度 激活剂激活剂 抑制剂抑制剂 研究一种因素研究一种因素 的影响时，其余的影响时，其余 各因素均恒定。各因素均恒定。 在其他因素不变在其他因素不变 的情况下，底物浓度的情况下，底物浓度 对反应速率的影响呈对反应速率的影响呈 矩形双曲线矩形双曲线关系。关系。 S V 底物浓度对反应速率的影响底物浓度对反应速率的影响 S：底物浓度：底物浓度 V：不同：不同S时的反应初速度时的反应初速度 Vmax：最大反应速度：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数：米氏常数(Michaelis constant) VmaxS Km + S

14、米曼式方程米曼式方程 解释酶促反应中底物浓度和反应速率关系的最合解释酶促反应中底物浓度和反应速率关系的最合 理的学说是中间产物学说。理的学说是中间产物学说。1913年年Michaelis和和 Menten提出米曼式方程。提出米曼式方程。 S V Km值值 Km等于等于酶促反应速度为最大反应速度一半时酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度的底物浓度。 意义：意义： a) Km是酶的是酶的特征性特征性常数之一；常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的可近似表示酶对底物的亲和力亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的同一酶对于不同底物有不同的Km值。值。 Km KmS 2 Km + S V

15、max VmaxS Vmax V S Km Vmax/2 双倒数作图法双倒数作图法 VmaxS Km+S V = （林贝氏方程）（林贝氏方程） + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/S 两边同取倒数两边同取倒数 m值与值与max值的测定值的测定 比色法比色法呈色原理呈色原理 p77 省去“酚含量标准曲线的制省去“酚含量标准曲线的制 备”备” 1/v=Km/Vmax1/S+1/Vmax v=CV/t C=A/kl 1/A=V/(klT)*(Km/Vmax*1/s+1/Vmax) 令1/A=0 （横截率），可得：1/Km=-1/S 与与k、L无关。无关。 实验步骤实验步骤 1. 按表按表

16、2-7-5配置溶液，注意先不加入酶液；配置溶液，注意先不加入酶液； 2. 配好配好8只试管的溶液后，开始加酶，混匀后立只试管的溶液后，开始加酶，混匀后立 即放入即放入37度水浴箱保温度水浴箱保温15分钟，并立即计时。分钟，并立即计时。 3. 保温结束后，立即加入碱性溶液保温结束后，立即加入碱性溶液1.0ml终止反终止反 应。此时，可以放置于室温。应。此时，可以放置于室温。 4. 等待其它试管都终止反应后，加入等待其它试管都终止反应后，加入0.3% 4-氨氨 基安替比林溶液基安替比林溶液1.0mL，0.5%铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液 2.0ml，充分混匀，放置，充分混匀，放置10分钟。分钟。 5.

17、 以第以第8管为空白管，在管为空白管，在510nm的波长下，测定的波长下，测定 各管的吸光度。各管的吸光度。 注意事项注意事项 1 底物和酶取样准确底物和酶取样准确 2 保温时间准确保温时间准确 1 2 3 4 5 6 7 加入酶的时加入酶的时 间间 加入碱性溶液加入碱性溶液 终止反应的终止反应的 时间时间 9:00:00 9:00:30 9:01:30 9:02:00 9:02:30 9:03:00 9:01:00 9:15:00 9:15:30 9:16:00 9:16:30 9:17:00 9:17:30 9:18:00 保证每个试管的反应时间为保证每个试管的反应时间为1515分钟分钟

18、实验报告实验报告 1 绘制矩形双曲线图绘制矩形双曲线图 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值值 注意事项注意事项 1 做如下表格做如下表格 2 可电脑作图可电脑作图 3 若人工作图，在坐标轴上禁止出现分数若人工作图，在坐标轴上禁止出现分数(1/2,1/16) 4 实验的最终目的是测得实验的最终目的是测得Km值，因此实验报告最终值，因此实验报告最终 必须得出结论：必须得出结论：Km值等于多少值等于多少 1 2 3 4 5 6 7 Abs S 1/ABS 1/S 实验四 聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离血清LDH Mi

19、n Zheng 电电 泳泳 Electrophoresis 一、定义一、定义 电泳电泳带电粒子在直流电场中向着电性带电粒子在直流电场中向着电性 相反电极移动的现象。相反电极移动的现象。 电泳分析技术电泳分析技术利用电泳现象进行物质利用电泳现象进行物质 分离的技术。分离的技术。 5 5. . 按支持物的装置形式不同按支持物的装置形式不同 a) 平板式电泳平板式电泳 b) 垂直板式电泳垂直板式电泳 c) 垂直柱式电泳垂直柱式电泳 电泳技术的特点电泳技术的特点: : 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分 离离, ,并可进行定性或定量分析并可进行定性或定量分析;

20、 ; 样品用量极少样品用量极少; ; 设备简单设备简单; ; 可在常温进行可在常温进行; ; 操作简便省时操作简便省时; ; 分辨率高分辨率高. . 四、电泳的基本原理四、电泳的基本原理 一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电 场中便会向正极或负极移动。场中便会向正极或负极移动。 移动速度移动速度以蛋白质分子为例以蛋白质分子为例: : F=F= EQEQ （Q Q：有效电荷有效电荷; ; E E：电位梯度电位梯度） F F = =6 6 r r v v （FF：摩擦阻力摩擦阻力; ; v v：在介质粘度在介质粘度 中半径中半径 为为r r的颗粒的移动速

21、度的颗粒的移动速度） F=FF=F EQ=EQ=6 6 r r v v E E Q Q v=v= 6 6 r r 迁移率迁移率（Mobility)Mobility)带电颗粒在单位带电颗粒在单位 电场强度下的泳动速度电场强度下的泳动速度。 V V Q Q MM = = = = E E 6 6 r r 五、影响电泳速度的因素五、影响电泳速度的因素 1 1. .电场强度电场强度（E E） EE电流电流热效应热效应支持介质上的水分蒸发支持介质上的水分蒸发样品样品 的热变性的热变性 EE电泳速度慢电泳速度慢延长电泳时间延长电泳时间样品扩散样品扩散区带模区带模 糊不清糊不清分辨率下降分辨率下降 2. 2.

22、 带点颗粒的半径带点颗粒的半径 r r 阻力阻力电泳速度变慢电泳速度变慢 3. 3. 支持物介质支持物介质吸附作用；电渗作用；分子筛作用吸附作用；电渗作用；分子筛作用 4 4缓冲液缓冲液 离子强度离子强度（I I）：II缓冲能力越大缓冲能力越大缓冲液所载的分缓冲液所载的分 电流增加电流增加，而样品所载的电流相应减少而样品所载的电流相应减少电泳速度减电泳速度减 慢慢 pHpH：pHpH值决定了化合物解离的程度值决定了化合物解离的程度，也决定了质点也决定了质点 所带的净电荷所带的净电荷。 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，

23、PAGE 一、一、PAGE PAGE 的的 组成组成 PAGEPAGE是由是由丙烯酰胺丙烯酰胺（AcrAcr）单体和单体和N N， NN- -亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺（BisBis）通过自由基聚合通过自由基聚合 而成的一种多孔三维网状结构而成的一种多孔三维网状结构。 AcrAcr + + BisBis 多孔三维网状结构多孔三维网状结构 二、二、PAGE PAGE 的的 聚聚 合合 需要催化剂需要催化剂氧化还原系统作用，使氧化还原系统作用，使AcrAcr单单 体带有游离基，从而与体带有游离基，从而与BisBis进行聚合。进行聚合。 化学聚合：化学聚合：APAP- -TEMEDTEMED系统：

24、过硫酸胺（系统：过硫酸胺（APAP） 作为催化剂，四甲基乙二胺（作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）为加速）为加速 剂。剂。 APAP在水溶液中能产生游离基在水溶液中能产生游离基SOSO4 42 2- -，使丙烯酰胺单使丙烯酰胺单 体的双键打开体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺活化形成自由基丙烯酰胺，然然 后游离后游离AcrAcr和和BisBis就能聚合形成凝胶就能聚合形成凝胶。 TEMEDTEMED的游离碱基能促进的游离碱基能促进APAP的形成的形成SOSO4 42 2- - 。 注意：注意： 升高温度能提高聚合升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合降低温度能延迟聚合。 三、分

25、离原理三、分离原理 1. 1. 浓缩效应浓缩效应 1 1）凝胶层的不连续性）凝胶层的不连续性 两层凝胶两层凝胶T T与与C C不同不同孔径不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中 移动，受阻力小，移动速度快移动，受阻力小，移动速度快。 2 2）缓冲液离子成分的不连续性）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（甘氨酸（pI=6.0pI=6.0）进入浓缩胶（）进入浓缩胶（pH6.7pH6.7），甘氨酸解离度），甘氨酸解离度 （a a）很小，有效迁移率（）很小，有效迁移率（M aM a）很低，移动速度较慢，）很低，移动速度较慢， 称

26、为慢离子。称为慢离子。 HCl HCl 是强电解质，是强电解质，a=1a=1，ClCl- -有效迁移率大，移动速度快，有效迁移率大，移动速度快， 称快离子。称快离子。 蛋白质（蛋白质（pIpI6.06.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。 pH8.3 TrispH8.3 Tris- -甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液 甘氨酸甘氨酸 HClHCl 蛋白质蛋白质 浓缩胶浓缩胶 分离胶分离胶 样品样品 PH=6.7 T=3% PH=8.9 T=5% 2 2. .分子筛效应与电荷效应分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，进入分离胶后，GlyGly- -成为快离子。分离胶只有

27、成为快离子。分离胶只有 电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电 荷不同、分子大小不同而分离荷不同、分子大小不同而分离 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶LDH 用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活 性染色液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪 (PMS)作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝 (NBT)作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递 给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的不溶于水 的物质以对LDH定位。反应式如下： LDH4 LDH3 LDH5 LDH1 LDH2 电泳结果实例电泳结果实例 + 1 1 加样加样(20uL)(20uL) 2 2 电泳（电泳（2mA/2mA/管，管，3030分钟；分钟；5 mA/5 mA/管，管，1h1h） 3 3 凝胶溶液的配置凝胶溶液的配置 4 4 凝胶管的制备凝胶管的制备 5 5 剥胶剥胶 6 6 染色染色 实验步骤实验步骤(p49)(p49) Thanks for your attention!Thanks for your attention!