医科大学精品课件：实验四、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH-徐燕.ppt

1、实验四实验四 电泳概述及原理电泳概述及原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色原理乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色原理 电泳的概念电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动带电物质在电场中向相反电极移动 的现象称为电泳（的现象称为电泳（electrophoresiselectrophoresis）。）。 电泳现象早在十九世纪初就已发现（电泳现象早在十九世纪初就已发现（18081808年俄国年俄国 物理学家物理学家ReRessss进行了世界上第一次电泳实验）进行了世界上第一次电泳实验） 。但电泳技术的广泛应用，则是在。但电泳技术的广泛应用，则是在1937193

2、7年用滤纸年用滤纸 作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近 几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电 泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等 领域得到了广泛应用。领域得到了广泛应用。 原则上按电泳的原理来分，可分为三类：原则上按电泳的原理来分，可分为三类： 自由界面电泳：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支又称移动界面电泳，是指在没有支 持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂 贵，费时费力，不便于推广应

3、用。贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在是指有支持介质的电泳，待分离物质在 支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要 是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成 分得到最大分辨率的分离。分得到最大分辨率的分离。 稳态电泳：稳态电泳：分子颗粒的迁移在一定的时间内即可达分子颗粒的迁移在一定的时间内即可达 到稳态，达到稳态后，带的宽度不随时间而改变。到稳态，达到稳态后，带的宽度不随时间而改变。 引引 言言 引引 言言 按按支持介质种类支持介质种类的不同，区带

4、电泳可分为：的不同，区带电泳可分为： 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为： 薄层电泳、薄层电泳、 板电泳、柱电泳板电泳、柱电泳。 据用途不同，可分为：据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、分析电泳、制备电泳、 定量、免疫电泳。定量、免疫电泳。 区带电泳由于采用的介质不同以及技术上区带电泳由于采用的介质不同以及技术上 的差异，又可分为不同的类型：的差异，又可分为不同的类型： 电泳是在电场的作用下而产生的物质运电泳是在电场的作用下而产生的物质运 动，不同的物质在一定的电场强度

5、下，动，不同的物质在一定的电场强度下， 由于所带电荷不同，因此受到的引力不由于所带电荷不同，因此受到的引力不 同，向相反电极泳动速度不同进而达到同，向相反电极泳动速度不同进而达到 分离目的。分离目的。 . 若将带净电荷若将带净电荷Q Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为 ： F F引 引= =E Q E Q （1） 在溶液中在溶液中, ,运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力F F阻 阻 F F阻 阻=6 =6r rV V 当当F F引 引= =F F阻阻时 时 EQ= 6EQ= 6r rV V V= V= 由上式可以看出由上式可

6、以看出, ,粒子的移动速度粒子的移动速度( (泳动速度泳动速度V)V)与电场强度与电场强度( (E)E) 和粒子所带电荷量和粒子所带电荷量( (Q)Q)成正比成正比, ,而与粒子的半径而与粒子的半径( (r)r)及溶液的粘度及溶液的粘度 ( () )成反比。成反比。非球形分子（如线状非球形分子（如线状DNADNA）在电泳过程中受到更大在电泳过程中受到更大 的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。 EQEQ 6 6r r （2） （3） （4） 在一定在一定pHpH条件下，每一种分子都具有特定条件下，每一种分子都具有特定 的电荷（种类和数量）、大小和形状，

7、在的电荷（种类和数量）、大小和形状，在 一定时间内它们在相同电场中泳动速度不一定时间内它们在相同电场中泳动速度不 同，各自集中到特定的位置上而形成紧密同，各自集中到特定的位置上而形成紧密 的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技 术进行分离、分析和鉴定的基本原理。术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 + - 丙烯酰胺（丙烯酰胺（AcrAcr，单体，单体）N,NN,N- -甲叉双丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺 （ BisBis，交联剂，交联剂）（催化剂）（催化剂）聚合聚合 催化剂：催化剂： （1 1）过硫酸铵过硫酸铵四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMEDTEMED） （2

8、2）核黄素（）核黄素（VitBVitB2 2）光）光 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体 浓度。浓度。 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包 括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。 T T为凝胶总浓度，为凝胶总浓度，C C为交联度。为交联度。 a a为丙烯酰胺单体的质量为丙烯酰胺单体的质量(g)(g)，b b为交联剂的质量为交联剂的质量(g)(g)，mm为溶液的终体积为溶液

9、的终体积( (mLmL) )。 凝胶凝胶a a、b b的比例决定了凝胶的物理性状。当的比例决定了凝胶的物理性状。当a:ba:b小于小于1010时，凝胶脆且硬，时，凝胶脆且硬， 不透明，呈乳白色；当不透明，呈乳白色；当a:ba:b大于大于100100时，即使用时，即使用5%5%的丙烯酰胺凝胶也呈的丙烯酰胺凝胶也呈 糊状；通常用糊状；通常用a:ba:b在在3030左右，并且丙烯酰胺浓度高于左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%3%，凝胶富有弹性，凝胶富有弹性 并且透明。并且透明。 %100 m ba T %100 ba b C 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理原理 四个不连续性四个不连

10、续性：凝胶浓度凝胶浓度的不连续性；的不连续性；缓冲液离子成分缓冲液离子成分的不的不 连续性；缓冲液连续性；缓冲液pHpH梯度梯度的不连续性；的不连续性；电位梯度电位梯度的不连续性。的不连续性。 三个效应：三个效应：浓缩效应、分子筛效应与电荷效应浓缩效应、分子筛效应与电荷效应 1. 1. 浓缩效应浓缩效应 1 1）凝胶层的不连续性）凝胶层的不连续性 两层凝胶两层凝胶T T与与C C不同不同 孔径不同孔径不同 浓缩胶：大孔径浓缩胶：大孔径 分离胶：小孔径分离胶：小孔径 2 2）缓冲液离子成分的不连续性）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸甘氨酸 （pI=6.0pI=6.0）在）在pH8.3pH8.3带

11、负电，朝正极移动，带负电，朝正极移动， 进入浓缩胶（进入浓缩胶（pH6.7pH6.7），甘氨酸解离度（），甘氨酸解离度（ ）很小，）很小， 有效迁移率（有效迁移率（M M ）很低，移动速度较慢，称为）很低，移动速度较慢，称为 慢离子慢离子。 HClHCl 强电解质，强电解质， =1=1，ClCl- -有效迁移率大，移动速度有效迁移率大，移动速度 快，称快，称快离子快离子。 蛋白质蛋白质（pIpI6.06.0）带负电荷，）带负电荷，有效迁移率介于两者有效迁移率介于两者 之间。之间。 pH8.3 TrispH8.3 Tris- -甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液 甘氨酸甘氨酸 ClCl- - 蛋白质蛋白质

12、 样品胶样品胶 浓缩胶浓缩胶 分离胶分离胶 样品样品 低 电 导 区 低 电 导 区 3 3）pHpH值的不连续性值的不连续性 为了控制慢离子的解离度为了控制慢离子的解离度，从而控制其从而控制其 有效迁移率有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间必须使浓缩胶与分离胶之间pHpH值值 有所区别有所区别。 2 2. .分子筛效应与电荷效应分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后进入分离胶后，GlyGly- -成为快离子成为快离子 分离胶只有分离胶只有电荷效应和分子筛效应电荷效应和分子筛效应，根据各根据各 蛋白质所带电荷不同蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离分子大小不同而分离 19591959年年Mark

13、ertMarkert等用电泳的方法将纯等用电泳的方法将纯 化的心肌乳酸脱氢酶化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)(LDH)分离出分离出5 5条区带，条区带， 由阳极到阴极依次命名为由阳极到阴极依次命名为LDHLDH1 1、LDHLDH2 2、LDHLDH3 3、 LDHLDH4 4、LDHLDH5 5。 【LDHLDH聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳】 将凝胶浸泡在活性染色液中，将凝胶浸泡在活性染色液中，LDHLDH与底物的反应与底物的反应 LDH4 LDH3 LDH5 LDH1 LDH2 1 2 3 4 【电泳结果实例电泳结果实例】 采用Pharmacia公司的SE250小型夹心 式垂直板电泳装

14、置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 1 1、凝胶制备、凝胶制备 2 2、电极缓冲液、电极缓冲液 3 3、样品处理及加样、样品处理及加样 4 4、电泳、电泳 5 5、染色、染色 试剂试剂 分离胶分离胶 浓缩胶浓缩胶 A A液液(ml)(ml) 1.81.8 B B液液(ml)(ml) 2.02.0 C C液液(ml)(ml) D D液液(ml)(ml) 0.70.7 1.41.4 蒸馏水蒸馏水(ml)(ml) 5.05.0 2.42.4 1% TEMED(ml)1% TEMED(ml) 0.50.5 0.20.2 1%1%过硫酸铵（过硫酸铵（mlml） 0.70.7 0.30.3 总体积总体积 10mL10mL 5.0mL5.0mL 胶浓度胶浓度 6%6% 3.5%3.5%