医科大学精品课件：wb质粒DNA的提取和鉴定 .ppt

1、 质粒质粒DNA的提取及鉴定的提取及鉴定 生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系 伍兵伍兵 实验目的实验目的 掌握质粒掌握质粒DNA制备的原理和方法制备的原理和方法 了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离 Bacterial DNA Plasmids 质粒质粒 碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液（含DNA) 酚/氯仿去蛋白 70%乙醇洗涤沉淀 乙醇沉淀DNA TE溶解DNA 电泳鉴定 溶液溶液： 50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖 10mmol/L EDTA 25mmol/L Tris-HCl pH8.0 溶液溶液II（新鲜配制）

2、（新鲜配制）: 1mol/L NaOH 200 l 10% SDS 100 l H2O 700 l 溶液溶液 III : 29.4g Kac 11.5ml冰醋酸冰醋酸 加水至加水至100ml 实验流程实验流程 1.细菌于细菌于LB培养基中培养过夜，分装（培养基中培养过夜，分装（1ml/支），支），4000rpm离心离心 2min，弃上清。，弃上清。 2.沉淀重悬于沉淀重悬于100 l溶液溶液中中, 震荡震荡混匀。混匀。 3.加入加入200 l新鲜配制新鲜配制的溶液的溶液，轻轻颠倒轻轻颠倒混匀混匀(不能超过不能超过5min）。）。 4.立即加入立即加入150 l溶液溶液，轻轻颠倒轻轻颠倒混匀，冰

3、浴混匀，冰浴5min，12000rpm 离心离心10min。 5.上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入等体积饱和酚等体积饱和酚，颠倒颠倒混匀，混匀， 12000rpm 离心离心10min。 6.上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入等体积酚等体积酚/氯仿氯仿，颠倒颠倒混匀，混匀， 12000rpm离心离心10min。 7.上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入2倍体积冷无水乙醇倍体积冷无水乙醇混匀，静混匀，静 置置5min，12000rpm离心离心10min。 8.弃上清，用弃上清，用0.5ml 70% 乙醇洗涤乙醇洗涤DNA，12000rpm离心离心5min弃上弃上 清，倒置干燥。清，倒置干燥。 9.加入加入10 l TE，1%琼脂糖凝胶电泳观察。琼脂糖凝胶电泳观察。 核酸的定量核酸的定量 260 nm， 1OD值相当于：值相当于： 双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml 单链单链DNA浓度为浓度为40 g/ml A260/A280 = 1.8（DNA） A260/A280 = 2.0（RNA）