培养基配制21课件.ppt

1、 293T细胞在不同血清及不同浓度血细胞在不同血清及不同浓度血清中的生长能力测试对比清中的生长能力测试对比 细胞培养学习成果报告 赵锋 2016.6.19甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司厂商厂商产品产品货号货号批号批号Biological IndustriesTest进口进口NBCS04-102-1 Biological IndustriesFBS04-001-1 Biological IndustriesDMEM-Hg01-100-1 Biological IndustriesPBS02-024-1 Biological Industries胰酶胰酶03-050-1

2、CORNINGT25V119297 备注：用备注：用 _ 细胞培养细胞培养I.实验目的：实验目的：293T细胞在不同血清及不同浓度血清中的生长能力测试对比。细胞在不同血清及不同浓度血清中的生长能力测试对比。II.实验材料：实验材料：宿主细胞来源：中国科学院上海细胞系宿主细胞来源：中国科学院上海细胞系 甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司.实验实验步骤步骤：1.细胞培养细胞培养前操作程序前操作程序 1.1 操作前准备步骤操作前准备步骤 1.1.1 培养基与胰酶等需用试剂，由冰箱取出，置于室温回温备用；培养基与胰酶等需用试剂，由冰箱取出，置于室温回温备用；同时开启生物操作柜同时

3、开启生物操作柜风机风机和和紫外光灯紫外光灯管电源，杀菌管电源，杀菌10-15分钟后切换至日分钟后切换至日光灯照明。光灯照明。1.1.2 确认确认C02培养箱与自制培养箱的温度设定应为培养箱与自制培养箱的温度设定应为37 C，二氧化碳浓，二氧化碳浓度应为度应为5%。所有操作步骤中，要进入生物操作柜的物品，都必定要均匀。所有操作步骤中，要进入生物操作柜的物品，都必定要均匀喷洒过喷洒过75%的酒精才可进入生物操作柜。操作人员戴上手套的手，进入的酒精才可进入生物操作柜。操作人员戴上手套的手，进入生物操作柜之前，也需均匀喷洒过酒精。生物操作柜之前，也需均匀喷洒过酒精。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程

4、生物科技发展有限公司2.培养基配制培养基配制 2.1 配制三种培养基配制三种培养基 DMEM-Hg+10%FBS DMEM-Hg+10%NBCS DMEM-Hg+20%NBCS 2.2无菌测试实验无菌测试实验 取一个六孔板，每个孔加入取一个六孔板，每个孔加入3ml培养基，每培养基，每 种培养基做两个平行，放入培养箱中培养种培养基做两个平行，放入培养箱中培养3天，中间天，中间连续观察六孔板菌落生长情况。连续观察六孔板菌落生长情况。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 2.2 培养基成分以及作用培养基成分以及作用 培养基培养基:缓冲盐缓冲盐,氨基酸氨基酸,维生素维生素,醣醣/碳

5、源碳源.血清血清/生长因子生长因子:生长因子生长因子,贴壁因子贴壁因子.培养培养环境环境:氧气氧气:参与能量代谢参与能量代谢.5%二氧化碳二氧化碳:维持酸碱平衡维持酸碱平衡.甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 Glutamine为细胞主要为细胞主要ATP来源来源.易易分解分解,半衰期半衰期:4为为一个月一个月,37 约约一周一周.BI基础培养基基础培养基:4 一年一年,谷氨酰胺谷氨酰胺 100mg/L.血清血清:生长因子生长因子,蛋白质蛋白质,脂肪脂肪,醣类醣类.血清替代物血清替代物:生长因子生长因子/蛋白质蛋白质.贴壁试剂贴壁试剂:细胞外基质细胞外基质,促贴壁因子促贴壁

6、因子.甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司3.细胞解冻细胞解冻 购买的细胞通常会将细胞、培养基和抗冻剂混购买的细胞通常会将细胞、培养基和抗冻剂混合之后装在冷冻小管中冷冻并存放于液态氮桶。合之后装在冷冻小管中冷冻并存放于液态氮桶。在在开始细胞培养开始细胞培养时，需时，需将冷冻小管解冻将冷冻小管解冻。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司3.1操作过程操作过程 将冷冻小管将冷冻小管（293T细胞）细胞）由液氮中取出置于室由液氮中取出置于室温回温当小管外面的霜溶化后就可拿到生物安全柜温回温当小管外面的霜溶化后就可拿到生物安全柜中操作以五毫升移液管吸取中操作以五毫

7、升移液管吸取4mL新鲜培养基小心冲新鲜培养基小心冲散管内冰块。用移液管将全部溶液转移至干净的散管内冰块。用移液管将全部溶液转移至干净的15 ml离心管中，再加入离心管中，再加入5mL新鲜培养基，拿到离心机新鲜培养基，拿到离心机以以1000 rpm离心离心5分钟。分钟。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 至生物操作柜中倒掉上清液，用移液管将残余至生物操作柜中倒掉上清液，用移液管将残余液体吸走。液体吸走。用干净的移液管抽取新鲜培养基，以吸放的方用干净的移液管抽取新鲜培养基，以吸放的方式将离心管中的细胞悬浮起来之后，即可将细胞与式将离心管中的细胞悬浮起来之后，即可将细胞与培养基

8、转移至培养皿中，将培养皿放入培养箱中来培养基转移至培养皿中，将培养皿放入培养箱中来培养。培养。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 隔日，为移除可能残余的抗冻剂，移除培养皿隔日，为移除可能残余的抗冻剂，移除培养皿中原有的培养基，用移液管再次加入新鲜的培养基，中原有的培养基，用移液管再次加入新鲜的培养基，继续于培养箱中培养。至此完成细胞解冻培养的程继续于培养箱中培养。至此完成细胞解冻培养的程序。序。观察无菌测试结果，在倒置显微镜下可以看到观察无菌测试结果，在倒置显微镜下可以看到血清中的纤维凝结，无菌落生长，可以使用。血清中的纤维凝结，无菌落生长，可以使用。甘肃鹏程生物科技发展

9、有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司4.细胞培养细胞培养 将培养于培养箱中的细胞进行继代培养，或是将培养于培养箱中的细胞进行继代培养，或是根据实验需求进行分盘。根据实验需求进行分盘。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司4.1操作过程操作过程 将培养皿自培养箱中取出，于生物安全柜中用移将培养皿自培养箱中取出，于生物安全柜中用移液管抽去所有溶液。液管抽去所有溶液。用用移液管吸取移液管吸取3-5mL的磷酸盐缓冲溶液的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，加，加入至培养皿中，以轻微摇晃的方式润洗细胞层，入至培养皿中，以轻微摇晃的方式润洗细胞层，之后用相同一支移液管将之后用相同一支移液管将PBS

10、 溶液吸取至废液收溶液吸取至废液收集瓶。集瓶。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 吸取吸取1-3mL的胰酶溶液，均匀加入至培养皿当中，的胰酶溶液，均匀加入至培养皿当中，放入培养箱中培养放入培养箱中培养 3-10分钟分钟(视不同细胞贴壁能力视不同细胞贴壁能力而定而定)。用用移液管吸取新鲜培养基冲散细胞，将细胞悬液移液管吸取新鲜培养基冲散细胞，将细胞悬液置于干净离心置于干净离心管管并进行细胞计数并进行细胞计数。通过计数得到细胞浓度：通过计数得到细胞浓度：5.3105个个/ml甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 通过计算，以总数通过计算，以总数1104个个

11、293T细胞接种到细胞接种到3种培种培养基中培养养基中培养2天后，计算细胞总数。天后，计算细胞总数。接种过程：取一个六孔板，每个孔加入接种过程：取一个六孔板，每个孔加入3ml培养培养基，每种培养基做两个平行，按基，每种培养基做两个平行，按100ul接种量接种接种量接种到每个孔中，轻轻摇匀后放入培养箱中培养。到每个孔中，轻轻摇匀后放入培养箱中培养。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 DMEM-Hg+10%FBS DMEM-Hg+10%NBCS DMEM-Hg+20%NBCS DMEM-Hg+10%FBS DMEM-Hg+10%NBCS DMEM-Hg+20%NBCS 每孔接

12、种每孔接种100ul293T细胞细胞甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司5.细胞计数细胞计数 计算细胞浓度或是细胞数目、存活率。计算细胞浓度或是细胞数目、存活率。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司5.1操作步骤：操作步骤：取出取出血球计数板血球计数板，用酒精擦拭其玻片与盖玻片表，用酒精擦拭其玻片与盖玻片表面。将盖玻片放置于玻片上。面。将盖玻片放置于玻片上。取取Trypan blue 10 l 于一干净于一干净 Eppendorf管上管上。用用移液器移液器以以 10 l 的培养基将细胞重新悬浮起来，的培养基将细胞重新悬浮起来，取出置于取出置于Eppend

13、orf 管管中，混合均匀。中，混合均匀。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 用移液器用移液器取取微量微量混合液混合液填充填充至其中一个至其中一个 chamber 中中(图右图右)。此时此时血球计数板血球计数板用倒立用倒立显微镜显微镜以以 10X 物镜观看物镜观看 chamber 中央。中央。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 数算区块数算区块 1、2、3、4、5 中的细胞数目之后平均中的细胞数目之后平均，得到平均数，得到平均数 A。此估计法为此估计法为A 在在 50-200 之间时估计较准确。之间时估计较准确。若此时若此时 A 大于大于 200，则需

14、稀释一倍之后再来计算，则需稀释一倍之后再来计算，直到，直到 A 介于介于 50-200 之间之间(图右图右)。细胞浓度细胞浓度=A Dilute factor 104 cells/ml.甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 Viability=(The#of unstained cellsThe total#of cells)100%细胞死亡后，细胞膜将破裂，此时细胞死亡后，细胞膜将破裂，此时 Trypan blue 进进入细胞中，细胞将被染成蓝色；活细胞则不会被入细胞中，细胞将被染成蓝色；活细胞则不会被染色呈淡蓝色或白色。藉由颜色的区分来分辨活染色呈淡蓝色或白色。藉由颜色

15、的区分来分辨活细胞与死细胞。计算五区的细胞与死细胞。计算五区的 viability 后取平均得后取平均得到细胞存活率。到细胞存活率。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司6.实验结果实验结果DMEM-Hg+10%FBS-1：5/4 2 104=2.5 104个/mlDMEM-Hg+10%FBS-2：12/4 2 104=6 104个/mlDMEM-Hg+10%NBCS-1：0/4 2 104=0个/mlDMEM-Hg+10%NBCS-2：0/4 2 104=0 个/mlDMEM-Hg+20%NBCS-1：19/4 2 104=9.5 104个/mlDMEM-Hg+20%NBC

16、S-2：14/4 2 104=7 104个/ml甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司7.鉴定血清的方法：鉴定血清的方法：理化性质：如渗透压、理化性质：如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量、球蛋白含量、血红蛋白含量等。清总蛋白含量、球蛋白含量、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。高。血红蛋白也

17、是越低越好。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测，支原体是一种很特别是对支原体、病毒的检测，支原体是一种很小的微生物，可通过孔径小的微生物，可通过孔径22u的滤膜。支原体、病的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。检测支原体的方法很繁殖，但会影响实验结果。检测支原体的方法很多，如培养法、多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法、荧光染色法、电镜观察法等。法等。甘肃鹏程生

18、物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 促生长效果：这是血清重要的特性之一，应当以促生长效果：这是血清重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测。有两种方法：克隆形成率、培养的细胞来检测。有两种方法：克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。贴瓶率测定法和连续传代培养法。（1）贴瓶率测定：是以贴壁细胞为培养对象，贴瓶率测定：是以贴壁细胞为培养对象，将细胞稀释至低密度，接种至平皿，每皿将细胞稀释至低密度，接种至平皿，每皿200或或100个细胞，以不同浓度的血清培养基培养，培养个细胞，以不同浓度的血清培养基培养，培养一定时间后弃培养基，染色后统计集落数，计算一定时间后弃培养基，染色后统计集落数

19、，计算出集落数占接种细胞数的百分比，同样再与标准出集落数占接种细胞数的百分比，同样再与标准血清比较，判断血清质量高低。血清比较，判断血清质量高低。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司（2）克隆形成率测定：一般以悬浮生长的细胞为克隆形成率测定：一般以悬浮生长的细胞为培养对象，按有限稀释法做克隆化培养，将不同批培养对象，按有限稀释法做克隆化培养，将不同批号的血清配制成不同浓度的培养基，细胞也稀释成号的血清配制成不同浓度的培养基，细胞也稀释成不同浓度，接种到不同浓度，接种到96孔板，每孔孔板，每孔200ul，培养一定时，培养一定时间，统计有克隆生长的孔，计算出百分比，再与对间，统

20、计有克隆生长的孔，计算出百分比，再与对照的标准血清相比较，就可看出不同批号血清间的照的标准血清相比较，就可看出不同批号血清间的区别。比较低的浓度，更能观察出血清质量间的细区别。比较低的浓度，更能观察出血清质量间的细微差别。微差别。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 （3）连续传代培养法：是将细胞培养于）连续传代培养法：是将细胞培养于3个一定体个一定体积的培养瓶中，待测血清配制为积的培养瓶中，待测血清配制为5浓度，一般于第浓度，一般于第七天收集细胞，计数，取平均值，中间可以更换一七天收集细胞，计数，取平均值，中间可以更换一次培养基。连续测试三个周期以上，观察细胞生长次培养基

21、。连续测试三个周期以上，观察细胞生长状况，并将每次的计数结果与标准血清的测试结果状况，并将每次的计数结果与标准血清的测试结果比较。比较。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司 对于使用者，判断血清质量先从外观入手。好的对于使用者，判断血清质量先从外观入手。好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。如发现血清浑浊、不透或极少沉淀，比较粘稠。如发现血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋明、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性；若血清呈棕红色，说明血清中的血红白质变性；若血清呈棕红色，说

22、明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象；如果摇晃时蛋白含量太高，取材时有溶血现象；如果摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。如果要进一步了解血清的质量，则应连续培养某如果要进一步了解血清的质量，则应连续培养某些细胞，观察细胞生长状况。些细胞，观察细胞生长状况。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司8.细胞培养中生长因子如何添加？细胞培养中生长因子如何添加？在细胞培养中使用的生长因子多为外源性的，在细胞培养中使用的生长因子多为外源性的，即直接在培养基中加入成品生长因子，外源生长因即直接在培养基中加入成品生长因子，外源生长因子的半衰期短，局部使用容易被稀释，而且要反复子的半衰期短，局部使用容易被稀释，而且要反复给药，另外，无论从浓度上还是从生长因子的种类给药，另外，无论从浓度上还是从生长因子的种类上说都是凭经验，没有具体的加入剂量和加入种类。上说都是凭经验，没有具体的加入剂量和加入种类。甘肃鹏程生物科技发展有限公司甘肃鹏程生物科技发展有限公司