医科大学精品课件：2014七年制 复制与修复.ppt

1、基因的分子生物学基因的分子生物学 福建医科大学福建医科大学 生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系 齐元麟齐元麟 yuanlin.qi QQ: 2287557 生物化学生物化学 第三篇第三篇 I consider molecular biology to be the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation. Molecular Biol

2、ogy - Robert Weaver 分子生物学在分子生物学在分子水平分子水平上研究上研究 核酸与蛋白质的核酸与蛋白质的功能功能 1. 基因组基因组在细胞和世代中的维持在细胞和世代中的维持 DNA的的复制复制、修复和重组、修复和重组 2. 基因的表达与调控基因的表达与调控 基因的基因的转录转录和和翻译翻译、蛋白质的修饰，原核与真核、蛋白质的修饰，原核与真核 基因基因表达调控表达调控 3. 基因表达与基因表达与细胞信号细胞信号的偶联的偶联 4. 分子生物学技术及其应用分子生物学技术及其应用 DNA操作技术、基因工程、基因诊断、基因治疗操作技术、基因工程、基因诊断、基因治疗 分子生物学发展简史分

3、子生物学发展简史 奠基时代奠基时代（18691952） 物理学与生物学的融合物理学与生物学的融合 遗传物质化学本质（遗传物质化学本质（DNA）的确定）的确定 黄金时代黄金时代（19531972） DNA双螺旋结构和复制机制的发现双螺旋结构和复制机制的发现 分子生物学所有基本原理于此诞生分子生物学所有基本原理于此诞生 基因工程时代基因工程时代（1973今）今） 基因工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展 分子生物学技术进入生命科学所有领域分子生物学技术进入生命科学所有领域 迈向“组学”时代迈向“组学”时代（2000 ） 兼顾“假说导向”与“发现导向”兼顾“假说导向”与“发现导向” 的科学研究方法的

4、科学研究方法 实验室为主体实验室为主体 规模化平台组合规模化平台组合 策略性强策略性强 战略性强战略性强 常规投入、随时启动常规投入、随时启动 持续投入、长期规划持续投入、长期规划 总费用低、单位费用高总费用低、单位费用高 总费用高、单位费用低总费用高、单位费用低 研究形式为假说驱动为主研究形式为假说驱动为主 研究形式为发现驱动为主研究形式为发现驱动为主 科学前沿问题科学前沿问题 科学前沿重大方向性问题科学前沿重大方向性问题 规范管理机制规范管理机制 创新管理机制创新管理机制 依赖领军科学家依赖领军科学家 依赖团队依赖团队 主学科聚焦主学科聚焦 多学科交叉多学科交叉 实验技术组合实验技术组合

5、技术平台组合技术平台组合 依赖技术积累依赖技术积累 依赖技术更新依赖技术更新 医学分子生物学的研究主题是医学分子生物学的研究主题是 健康与疾病的分子机制健康与疾病的分子机制 人类发育调控和功能调控的分子基础人类发育调控和功能调控的分子基础 疾病的分子机制疾病的分子机制 生物工程与生物制药生物工程与生物制药 预防医学预防医学 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 分子生物学在医学领域的应用分子生物学在医学领域的应用 用基因敲除技术探讨发育的分子机制用基因敲除技术探讨发育的分子机制 单个抑癌基因的突变即可导致肿瘤的发生单个抑癌基因的突变即可导致肿瘤的发生 重组蛋白技术用于药物生产重组蛋白技术用于药

6、物生产 这些金色的转基因大米里含有这些金色的转基因大米里含有 b b-胡萝卜素胡萝卜素, 食用这种大米可以预防维生素食用这种大米可以预防维生素A缺乏症。缺乏症。 RFLP技术在法医学中的应用技术在法医学中的应用 Defendants blood Blood from defendants clothes Victims blood DNA的合成及重组的合成及重组 DNA Biosynthesis and Recombination 第十六章第十六章 DNA生物合成生物合成 DNA复制复制 （DNA指导的指导的DNA合成合成） 逆转录逆转录 ( (逆转录病毒逆转录病毒RNA指导的指导的DNA合成

7、合成) 校正复制中可能出现的错误，并修复受到损校正复制中可能出现的错误，并修复受到损 伤的伤的DNA 细胞中酶促修复系统细胞中酶促修复系统 自然界自然界DNADNA重组和基因转移的基本方式重组和基因转移的基本方式 基因组复制的主要特点基因组复制的主要特点 The General features of Genome Replication 第一节第一节 一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息 的总和的总和 含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质， 称为称为基因组（基因组（genome）。在真核生物体中，基因组。在真核生物体中

8、，基因组 是指一套完整单倍体是指一套完整单倍体DNA（染色体（染色体DNA）和线粒体）和线粒体 DNA的全部序列。的全部序列。 核基因组核基因组 线粒体基因组线粒体基因组 人类基因组包括人类基因组包括 人类基因人类基因组（组（Genome） 人类基因组人类基因组包含包含22条常染色体条常染色体和和X、Y两条两条 性染色体性染色体上的遗传物质上的遗传物质（核基因组核基因组）和和线粒线粒 体体的遗传物质的遗传物质（线粒体基因组线粒体基因组）。 人类染色体的人类染色体的RxFISH图谱图谱 基因基因 假基因假基因 重复重复 序列序列 人类基因组人类基因组7号染色体号染色体b b-TCR基因座的某基因

9、座的某50kb区域区域 基因基因 片段片段 全长全长16,569bp， 含含37个基因个基因。 其中其中13个基因个基因编编 码码蛋白质蛋白质， 其余其余24个编码个编码 rRNA和和tRNA。 人线粒体基因组图谱人线粒体基因组图谱 人类人类基因组各成分基因组各成分所所占比例占比例 二、基因组二、基因组DNA复制具备一些共同特征复制具备一些共同特征 1. 复制是复制是半保留半保留的的 2. 在复制的生长点形成在复制的生长点形成复制叉复制叉 3. 复制是复制是双向双向的的 4. 复制是复制是半不连续半不连续的的 5. 复制起点复制起点由多个短重复序列组成由多个短重复序列组成 6. DNA的复制必

10、须有的复制必须有引物引物 7. 复制需要多种复制需要多种酶酶和和蛋白因子蛋白因子的参与的参与 8. 基因组复制是基因组复制是高保真高保真的的 1. DNA复制是复制是半保留复制半保留复制 DNA双螺旋中的每一条链都双螺旋中的每一条链都 作为合成互补链的模板，作为合成互补链的模板， 其结果就使得两条子代的双其结果就使得两条子代的双 螺旋都和母本完全一致。螺旋都和母本完全一致。 Meselson-Stahl实验实验 2. DNA复制的生长点形成复制的生长点形成复制叉复制叉 复制叉复制叉 复制叉复制叉 复制泡复制泡 复制起点复制起点 3. DNA复制是复制是双向复制双向复制 4. DNA复制是复制是

11、半不连续复制半不连续复制 冈崎片段冈崎片段 两个原因造成了两个原因造成了DNA的半不连续复制：的半不连续复制： DNA双链是双链是反向平行的反向平行的； DNA合成的方向只能是合成的方向只能是5-3。 在一条模板上，在一条模板上，DNA能进行连续的合成，能进行连续的合成，DNA聚聚 合酶简单地尾随着复制叉，此模板所指导合成的新合酶简单地尾随着复制叉，此模板所指导合成的新 DNA链称为链称为前导链前导链。 在另一条模板上，在另一条模板上，DNA聚合酶与复制叉做反向运聚合酶与复制叉做反向运 动，此模板指导合成的是动，此模板指导合成的是后随链后随链。 后随链上形成的新链后随链上形成的新链DNA片段，

12、称为片段，称为冈崎片段冈崎片段。 5. 复制起点复制起点有特殊的结构有特殊的结构 复制的起始并非一个随机的过程，它总是在复制的起始并非一个随机的过程，它总是在DNA 分子上的同一个或多个位置开始的，这些位点被分子上的同一个或多个位置开始的，这些位点被 称为称为复制起始点复制起始点（Origin of Replication）。）。 环状的细菌基因组只有一个复制起点，这意味着环状的细菌基因组只有一个复制起点，这意味着 每一个复制叉要复制几千每一个复制叉要复制几千kb的的DNA。 酿酒酵母约有酿酒酵母约有300个复制起点，每一个起点对应个复制起点，每一个起点对应 40kb；而人类有；而人类有20,

13、000个起点，每个起点对应约个起点，每个起点对应约 150kb的的DNA。 GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 1 13 17 29 32 44 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 58 66 166 174 201 209 237 24245 5 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列 5 3 5 3 E.coli复制起始点复制起始点 oriC 真核生物有多个复制起始点真核生物有多个复制起始点 酿酒酵母的第

14、三号染色体是已知最小的真核生酿酒酵母的第三号染色体是已知最小的真核生 物染色体，它包含物染色体，它包含180个基因和个基因和 9 个复制起点。个复制起点。 真核生物复制起始点的结构真核生物复制起始点的结构 复制起点（复制起点（OBR） 由一些由一些短重复序列短重复序列 组成。组成。 酵母酵母OBR结构已被结构已被 阐明，哺乳动物阐明，哺乳动物 OBR精细结构尚在精细结构尚在 研究中。研究中。 结合结合OBR并启动复并启动复 制的制的蛋白复合物蛋白复合物称称 为为复制起点复合物复制起点复合物 （ORC）。）。 6. DNA复制需要复制需要引物引物 多数多数DNA复制使用复制使用新合成的短新合成的

15、短RNA引物。引物。 个别个别DNA复制以复制以DNA、tRNA或蛋白质做引物。或蛋白质做引物。 7. 复制需要多种复制需要多种酶酶和和蛋白因子蛋白因子的参与的参与 原核生物原核生物 真核生物真核生物 引物酶引物酶 DnaG DNA聚合酶聚合酶 DNA解螺旋酶解螺旋酶 DnaB Mcm2-7 SSB SSB RPA 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶 II 拓扑异构酶拓扑异构酶 I、II 8. 基因组复制是基因组复制是高保真高保真的的 DNA聚合酶每添加聚合酶每添加105个核苷酸中，仅掺入一个核苷酸中，仅掺入一 个不正确的核苷酸；个不正确的核苷酸； 校正外切核酸酶使不正确配对的的概率降

16、低到校正外切核酸酶使不正确配对的的概率降低到 10-7； 错配修复系统使最终的出错机率降低到错配修复系统使最终的出错机率降低到10-10。 这相当于每复制这相当于每复制1000个细菌基因组，仅出现一个个细菌基因组，仅出现一个 错误的核苷酸。错误的核苷酸。 三、不同基因组三、不同基因组DNA通过不同的模式通过不同的模式 进行复制进行复制 （一）真核生物基因组（一）真核生物基因组DNADNA复制过程涉及反转录复制过程涉及反转录 （端粒的复制）（端粒的复制） （二）单链二）单链DNADNA病毒病毒基因组基因组通过复制中间体复制通过复制中间体复制 （三）三）HBVHBV基因组通过基因组通过RNARNA

17、中间体进行复制中间体进行复制 （四）双链环状（四）双链环状DNADNA也有不同的复制方式也有不同的复制方式 DNA复制过程复制过程 Process of DNA Replication 第二节第二节 一、细菌的一、细菌的DNADNA复制复制 复制的起始复制的起始 复制叉上的复制叉上的DNA复制复制 复制的终止复制的终止 E.coli 复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 1 13 17 29 32 44 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA 5

18、8 66 166 174 201 209 237 58 66 166 174 201 209 237 24245 5 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列 5 3 5 3 E.coli DNA复制复制起始和复制叉的形成起始和复制叉的形成 在在E.coli复制起始过程中复制起始过程中，DnaA、DnaB/C（解螺解螺 旋酶旋酶）、DnaG（引物酶引物酶）和和DNA聚合酶聚合酶III依次依次 加入加入，形成最初的复制叉形成最初的复制叉。 1. DNA聚合酶催化的复制反应聚合酶催化的复制反应 2. 复制叉上的复制叉上的DNA合成合成 （一）（一）DNA聚合酶催化的聚合酶催化的复制反应复

19、制反应 DNA复制反应的底物是复制反应的底物是 dNTP和和引物引物- -模板连接处模板连接处 反应由反应由DNA聚合酶聚合酶催化催化 聚合酶聚合酶 活性中心活性中心 外切核酸酶外切核酸酶 活性中心活性中心 所有的所有的DNA聚合酶都有聚合酶都有相似的空间结构相似的空间结构 与与DNA聚合酶结合的聚合酶结合的金属离子金属离子催化核苷酸的添加催化核苷酸的添加 DNA聚合酶能分辨聚合酶能分辨正确正确与与错误的碱基错误的碱基 DNA聚合酶能分辨聚合酶能分辨dNTP与与NTP DNA聚合酶具有聚合酶具有延伸能力延伸能力 DNA聚合酶的聚合酶的延伸能力延伸能力（processivity）定义为）定义为

20、每次酶与引物每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的模板接头结合时所添加核苷酸的 平均数；平均数； 每种每种DNA聚合酶都有其特征性的延伸能力，从聚合酶都有其特征性的延伸能力，从 几个到几个到50000个核苷酸不等；个核苷酸不等； DNA聚合酶与完全包围聚合酶与完全包围DNA的“的“滑动夹滑动夹”蛋白”蛋白 之间的相互作用，可进一步提高延伸能力。之间的相互作用，可进一步提高延伸能力。 外切核酸酶活性外切核酸酶活性校正校正新合成的新合成的DNA 影响影响DNA聚合酶精确度聚合酶精确度 的主要因素是碱基变成的主要因素是碱基变成 “错误”的互变异构体“错误”的互变异构体 （亚氨基或烯醇基）；（亚氨

21、基或烯醇基）； 错配的核苷酸错配的核苷酸激活激活3-5 外切核酸酶活性外切核酸酶活性； 错配核苷酸去除后，构错配核苷酸去除后，构 象恢复，象恢复，DNA聚合反应聚合反应 继续进行。继续进行。 （二）复制叉上的（二）复制叉上的DNA合成合成 前面我们讨论了引物前面我们讨论了引物-模板接头处模板接头处DNA的合成，的合成， 然而在细胞内，然而在细胞内，DNA的双链是同时复制的。这的双链是同时复制的。这 就必须解决：就必须解决： 半不连续复制半不连续复制； RNA引物引物的合成和去除；的合成和去除； 解开复制叉解开复制叉及相关的拓扑学问题。及相关的拓扑学问题。 复制叉上复制叉上DNA的合成是半不连续

22、的的合成是半不连续的 前导链前导链 后随链后随链 合成方向与解链方向合成方向与解链方向相同相同 合成方向与解链方向合成方向与解链方向相反相反 RNA引物的合成与去除引物的合成与去除 所有的所有的DNA聚合酶都不能从头合成聚合酶都不能从头合成DNA链；链； RNA聚合酶聚合酶具有从头合成核苷酸链的能力；具有从头合成核苷酸链的能力； 细胞利用一种特殊的细胞利用一种特殊的RNA聚合酶来启动复制：聚合酶来启动复制： 引物酶引物酶，能在单链，能在单链DNA模板上合成模板上合成5-10个核苷个核苷 酸长度的酸长度的短短RNA引物引物，DNA聚合酶随后延伸这聚合酶随后延伸这 些引物。些引物。 E.coli的

23、引物酶是的引物酶是DnaG蛋白蛋白，真核生物的引物，真核生物的引物 酶是酶是DNA聚合酶聚合酶 的的p48亚基。亚基。 原核与真核生物原核与真核生物RNA引物的合成引物的合成 聚合酶转换聚合酶转换 RNA引物的去除引物的去除 RNase H可去除可去除DNA:RNA杂交链中的杂交链中的RNA； DNA聚合酶（聚合酶（ E.coli中是中是DNA聚合酶聚合酶 I，真核，真核 生物中目前认为是生物中目前认为是DNA聚合酶聚合酶 或或 ）填补去）填补去 除引物后留下的空隙（除引物后留下的空隙（gap）；）； DNA连接酶连接酶连接两个相邻的核苷酸。连接两个相邻的核苷酸。 在复制叉上有多种蛋白质协同解

24、开双螺旋在复制叉上有多种蛋白质协同解开双螺旋 DNA聚合酶本身不能解开双螺旋，因此还需要多聚合酶本身不能解开双螺旋，因此还需要多 种酶和蛋白因子的协同作用，它们完成以下三项种酶和蛋白因子的协同作用，它们完成以下三项 任务：任务： 将将DNA双螺旋分开双螺旋分开以形成两条单链以形成两条单链DNA模板；模板； 保证复制前单链保证复制前单链DNA保持伸直状态保持伸直状态； 解决分开解决分开DNA双螺旋而引起的双螺旋而引起的拓扑学问题拓扑学问题。 解螺旋酶解螺旋酶解开解开DNA双螺旋双螺旋 DNA解螺旋酶通常是解螺旋酶通常是 六聚体六聚体蛋白，环绕着蛋白，环绕着 DNA，因此有很高的，因此有很高的 延

25、伸能力延伸能力； 解螺旋酶利用解螺旋酶利用ATP的的 能量解开双螺旋；能量解开双螺旋； 所有解螺旋酶都有所有解螺旋酶都有极极 性性（polarity），即特），即特 异性地结合异性地结合DNA双链双链 中的一条。中的一条。 E.coli的解螺旋酶是的解螺旋酶是DnaB蛋白蛋白，它本身是六聚体，它本身是六聚体， 又与六个又与六个DnaC蛋白蛋白共同组成解螺旋复合物；共同组成解螺旋复合物； 人类的解螺旋酶目前认为是人类的解螺旋酶目前认为是Mcm2-7复合物，同样复合物，同样 是六聚体；是六聚体； DnaB解螺旋方向为解螺旋方向为5-3，即结合，即结合后随链的模板后随链的模板。 单链结合蛋白单链结合

26、蛋白使单链使单链DNA稳定稳定 DNA解螺旋酶打开双螺旋后，新生成的单链解螺旋酶打开双螺旋后，新生成的单链DNA必必 须保持碱基未配对的状态，直至成为模板。须保持碱基未配对的状态，直至成为模板。 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白（SSB）结合到单链）结合到单链DNA上，上， 使单链模板保持伸直的状态。使单链模板保持伸直的状态。 人类的单链结合蛋白是人类的单链结合蛋白是RPA蛋白，它是异三聚体，蛋白，它是异三聚体， 三个亚基分别是三个亚基分别是p70、p34、p11。 拓扑异构酶拓扑异构酶除去解螺旋时产生的超螺旋除去解螺旋时产生的超螺旋 DNA复制中的拓扑学难题：复制中的拓扑学难题： 在解链过程中

27、伴随着在解链过程中伴随着DNA分子的旋转：双螺旋中分子的旋转：双螺旋中 每每10bp形成一周；形成一周； 以人的以人的1号染色体为例，号染色体为例，1号染色体长号染色体长250Mb，复，复 制时就必须旋转制时就必须旋转2500万次；万次； 细菌和噬菌体等环状基因组，则不可能以旋转的细菌和噬菌体等环状基因组，则不可能以旋转的 方式解螺旋。方式解螺旋。 解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成 拓扑异拓扑异 构酶构酶 切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA 解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封 闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态。变为松弛状态。 反应反应不

28、需不需ATP。 拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶的作用机制 拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶的作用机制 拓扑异拓扑异 构酶构酶 切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。 利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。 本图显示本图显示拓扑异构酶拓扑异构酶 II 除除 去由复制叉所产生的正超去由复制叉所产生的正超 螺旋：螺旋： 通过“通过“断裂断裂-再连接再连接”的”的 方式，将未复制的方式，将未复制的DNA 的一部分通过未复制区的一部分通过未复制区 域的断裂点以消除正超域的断裂点以消除

29、正超 螺旋。螺旋。 该反应使连环数减少该反应使连环数减少2， 因此每复制因此每复制20bp将会发将会发 生一次。生一次。 复制叉酶扩大了复制叉酶扩大了DNA聚合酶的底物范围聚合酶的底物范围 DNA聚合酶本身只能延伸已合成的引物，但是引物聚合酶本身只能延伸已合成的引物，但是引物 酶、解螺旋酶和拓扑异构酶的加入极大地扩大了酶、解螺旋酶和拓扑异构酶的加入极大地扩大了 DNA聚合酶可能的底物范围：聚合酶可能的底物范围： 引物酶引物酶使得使得DNA聚合酶能复制任何聚合酶能复制任何单链单链DNA； DNA解螺旋酶解螺旋酶和和拓扑异构酶拓扑异构酶使得使得DNA聚合酶能复聚合酶能复 制任何制任何双链双链DNA

30、。 没有这些酶的参与，复制叉是不可想象的。没有这些酶的参与，复制叉是不可想象的。 DNA聚合酶是聚合酶是高度特化高度特化的的 细胞内有多种细胞内有多种DNA聚合酶，它们为执行不同的生物聚合酶，它们为执行不同的生物 学功能而高度特化了：学功能而高度特化了： E.coli有有5种种DNA聚合酶，其中聚合酶，其中Pol III是复制酶；是复制酶； 真核生物有超过真核生物有超过10种种DNA聚合酶，其中聚合酶，其中DNA聚合聚合 酶酶 有引物酶活性，有引物酶活性，DNA聚合酶聚合酶 和和 是复制酶是复制酶。 TLS 1 Rev 1 TLS，体细胞高变，体细胞高变 1 Pol 相对准确的相对准确的TLS

31、（穿越环丁烷二聚体）（穿越环丁烷二聚体） 1 Pol TLS 1 Pol 体细胞高变（体细胞高变（somatic hypermutation） 1 Pol 减数分裂相关的减数分裂相关的DNA损伤修复损伤修复 1 Pol TLS 1 Pol DNA交联损伤修复交联损伤修复 1 Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复 4 Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复 23 Pol 线粒体线粒体DNA复制和损伤修复复制和损伤修复 3 Pol 碱基切除修复碱基切除修复 1 Pol b b 合成引物合成引物 4 Pol 功

32、功 能能 亚基数目亚基数目 真核生物真核生物 TLS（translesion synthesis） 3 Pol (UmuC, UmuD) DNA损伤修复，穿越损伤合成（损伤修复，穿越损伤合成（TLS） 1 Pol (Din B) 染色体染色体DNA复制复制 9 Pol 全酶全酶 染色体染色体DNA复制复制 3 Pol 核心酶核心酶 DNA损伤修复损伤修复 1 Pol 去除去除RNA引物，引物，DNA损伤修复损伤修复 1 Pol 功功 能能 亚基数目亚基数目 原核生物（原核生物（E. coli） 延伸能力差，只能延伸延伸能力差，只能延伸20个核苷酸左右。个核苷酸左右。 功能：切除引物，填补冈崎片

33、段间的空隙、功能：切除引物，填补冈崎片段间的空隙、 DNA损伤的修复。损伤的修复。 DNA pol I （109kD） 323个氨基酸个氨基酸 小片段小片段 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸 DNA聚合酶聚合酶活性活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 N 端端 C 端端 枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 DNA pol I Klenow片段片段是实验室合成是实验室合成DNA，进行，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 2个个核心酶核心酶（ 、 、 3种亚基）种亚基） 1个个 复合物复合物（ 、 、 、 、

34、 、 6种亚基）种亚基） 可滑动的可滑动的DNA夹子夹子（含（含1对对b b-亚基）亚基） DNA聚合酶聚合酶III的结构的结构 全酶结构包括：全酶结构包括： 一次延伸达一次延伸达500000个核苷酸个核苷酸，催化速度达催化速度达1000bp/s， 有校对功能有校对功能，是细菌复制延长中真正起催化作用的是细菌复制延长中真正起催化作用的 酶酶。 亚基亚基有聚合酶活性有聚合酶活性 亚基亚基有有3-5校正核校正核 酸酶活性酸酶活性 b b亚基亚基协助核心酶固协助核心酶固 定在定在DNA模板上模板上 复合物复合物连接两个核连接两个核 心酶心酶 细菌复制叉上细菌复制叉上DNA的合成（小结）的合成（小结）

35、 复制叉上的前导链和后随链同时合成；复制叉上的前导链和后随链同时合成； DNA聚合酶聚合酶III全酶同时复制全酶同时复制DNA的双链；的双链； 前导链迅速复制。后随链进行不连续的合成；前导链迅速复制。后随链进行不连续的合成； 引物酶、解螺旋酶、拓扑异构酶和引物酶、解螺旋酶、拓扑异构酶和SSB蛋白协蛋白协 助助DNA聚合酶聚合酶III完成复制过程。完成复制过程。 以上统称“以上统称“长号模型长号模型”。”。 E.coli基因组的复制终止基因组的复制终止 E.coli基因组复制由基因组复制由 oriC开始，到开始，到ter终止；终止； Tus蛋白蛋白识别复制终点识别复制终点 使复制终止；使复制终止

36、； 复制完成还包括去除引复制完成还包括去除引 物和连接冈崎片段；物和连接冈崎片段； 拓扑异构酶解开套在一拓扑异构酶解开套在一 起的两个起的两个DNA分子。分子。 复制受到复制受到DnaA-ATP水平和水平和SeqA的调控的调控 E.coli基因组的基因组的oriC的的GATC序列（双链）的序列（双链）的A通常通常 是是甲基化甲基化的，只有甲基化的的，只有甲基化的oriC可启动复制。新合可启动复制。新合 成链成链oriC的的GATC在未甲基化之前，可与在未甲基化之前，可与SeqA蛋白蛋白 结合，而丧失启动复制的能力；结合，而丧失启动复制的能力； DnaA-ATP蛋白在复制过程中转变为蛋白在复制过

37、程中转变为DnaA-ADP， 而丧失启动复制的能力；而丧失启动复制的能力； 以上机制共同使以上机制共同使E.coli在在oriC的新拷贝上启动新一的新拷贝上启动新一 轮复制的能力显著降低。轮复制的能力显著降低。 虽然如此，但这并不意味着虽然如此，但这并不意味着E.coli的的oriC在一轮复在一轮复 制周期中就只起一次作用；制周期中就只起一次作用； E.coli每每20分钟就分裂一次，而基因组的复制时间分钟就分裂一次，而基因组的复制时间 就需要就需要40分钟，在快速生长期，基因组分钟，在快速生长期，基因组在上一轮复在上一轮复 制完成之前就要启动下一轮复制制完成之前就要启动下一轮复制，而使染色体

38、上出，而使染色体上出 现现6个复制叉；个复制叉； 所以，确切的说法是：所以，确切的说法是：每一轮细胞分裂只有一轮自每一轮细胞分裂只有一轮自 oriC的复制起始的复制起始。 真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉 前进速度慢等；前进速度慢等； DNA复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚聚 合酶合酶 / 转换；转换； 切除冈崎片段切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶引物的是核酸酶RNase H和和FEN1等。等。 二、真核生物的二、真核生物的DNA复制复制 真核生物与原核生物真核生物与原核生物DNA复制的差异：复制的差异： ( (一一) )常见

39、的真核细胞常见的真核细胞DNA聚合酶有聚合酶有5种种 A家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌Pol同源同源，包括包括Pol 和和Pol B家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌Pol 同源同源，包括包括Pol 、 、 和和 C家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌Pol 同源同源，仅在真菌中发现仅在真菌中发现 X家族家族与大肠杆菌与大肠杆菌DNA聚合酶并无同源性聚合酶并无同源性，却与末却与末 端转移酶同源端转移酶同源，成员包括成员包括Pol b b、 、 Y家族家族（ UmuC/DinB超家族超家族），近年发现一个特殊近年发现一个特殊 的真核及原核的真核及原核DNA聚合酶家族聚合酶家族，成员包括成员包括Pol 、 、 和

40、和Rev1 Pol 负责合成引物负责合成引物 Pol 负责负责DNA复制、核苷酸切除修复和碱基切除复制、核苷酸切除修复和碱基切除 修复修复 Pol 的功能与的功能与Pol 相似（其确切功能尚待定）相似（其确切功能尚待定） Pol b b可能和碱基切除修复有关可能和碱基切除修复有关 Pol 负责线粒体负责线粒体DNA复制和损伤修复复制和损伤修复 常见的真核常见的真核DNA聚合酶有聚合酶有5种：种： 拓扑异构酶拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前 方产生的正超螺旋方产生的正超螺旋 Tol和和Tol DNA双螺旋解链双螺旋解链，参

41、与组装引发体，参与组装引发体 DNA解旋酶解旋酶 连接冈崎片段连接冈崎片段 DNA连接酶连接酶 核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物 RNase H 核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物 FEN1 DNA复制复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复，核苷酸切除修复，碱基切除修复 Pol / 合成合成RNA-DNA引物引物 Pol /引发酶引发酶 夹子装载器夹子装载器，促使，促使PCNA结合于引物结合于引物-模板链，有依赖模板链，有依赖DNA的的ATPase 活性，结合于引物活性，结合于引物-模板链，激活模板链，激活DNA聚合酶聚合酶 RFC 可滑动的可滑动的DNA夹子夹子，激活，激活DNA聚合酶

42、和聚合酶和RFC的的ATPase活性活性 PCNA 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白，激活，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易结合聚合酶，使解旋酶容易结合DNA RPA 功功 能能 蛋白质蛋白质 真核真核DNA复制叉主要蛋白质的功能复制叉主要蛋白质的功能 ( (二二) )真核真核DNADNA复制叉主要蛋白质的类型和功能复制叉主要蛋白质的类型和功能 与原核基本相似与原核基本相似 DNA聚合酶聚合酶 （Pol ）分子含有）分子含有4个亚基：个亚基： 1. DNA聚合酶聚合酶 /引发酶复合物合成引发酶复合物合成RNA-DNA引物引物 p180：催化亚基：催化亚基 p48：具有：具有引物酶引物酶活性活性 p

43、58：p48的稳定性和活性所必需的的稳定性和活性所必需的 p70：与组装引发体有关：与组装引发体有关 功能功能：合成：合成RNA引物引物 反应过程反应过程： 调节调节：磷酸化的调节作用：磷酸化的调节作用 Pol /引发酶复合物引发酶复合物 首先，合成首先，合成RNA引物；引物； 其次，利用其次，利用DNA聚合酶活性将引物延伸，产生起始聚合酶活性将引物延伸，产生起始 DNA（initiator DNA，iDNA）短序列，形成）短序列，形成 RNA-DNA引物；引物； 最后，最后，Pol /引发酶脱离模板链引发酶脱离模板链DNA，发生，发生DNA聚合聚合 酶转换（酶转换（switch）。）。 原核

44、与真核生物原核与真核生物RNA引物的合成引物的合成 聚合酶转换聚合酶转换 结构：结构： p70、p34和和p11组成异源三聚体组成异源三聚体 功能：功能： 2. RPA的功能与的功能与E.coli的的SSB相似相似 复制蛋白复制蛋白A（replication protein A，RPA） 结合单链结合单链DNA 促使双螺旋促使双螺旋DNA解旋解旋 激活激活Pol /引发酶活性引发酶活性 为为Pol 依赖复制因子依赖复制因子C（RFC）和增殖细胞核抗原）和增殖细胞核抗原 （PCNA）合成）合成DNA所必需所必需 RPA三聚体与三聚体与SV40 T抗原结合，组装引发体复合物所必需抗原结合，组装引发

45、体复合物所必需 RPA参与参与DNA重组和修复重组和修复 p140 结合结合PCNA p40、p37和和p36组成稳定的核心复合物，具有组成稳定的核心复合物，具有 依赖依赖DNA的的ATPase活性活性 p38可能在可能在p140和核心复合物之间起连接作用和核心复合物之间起连接作用 3. RFC与与E.coli DNA聚合酶聚合酶的的 -复合物复合物功能相似功能相似 复制因子复制因子C（replication factor C，RFC） 结构：结构：有有p140，p40，p38，p37、p36 5个亚基个亚基 促使可滑动的促使可滑动的DNA夹子夹子PCNA结合于引物结合于引物- 模板链模板链，

46、是，是Pol 在模板在模板DNA链上组装并形成具链上组装并形成具 有持续合成能力全酶所必需的。有持续合成能力全酶所必需的。 RFC的功能：的功能： PCNA是是Pol 的进行性因子，使的进行性因子，使Pol 获得持续合成能力。获得持续合成能力。 PCNA是协调是协调DNA复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期 调控的核心因子。调控的核心因子。 PCNA水平是检测细胞增殖的重要指标。水平是检测细胞增殖的重要指标。 PCNA能激活能激活Pol 。 4. PCNA是是可滑动的可滑动的DNA夹子夹子 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 结构：结构： 功能：功能： 同源三聚体，可形成闭合