高效液相色谱分析法课件.ppt
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1、2023-1-27第二第二第二第二第二第二十十十十十十章章章章章章高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法一、一、高效液相色谱法的主要类型高效液相色谱法的主要类型和原理和原理二、高效液相色谱法的固定相和二、高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择流动相及其选择三、三、高效液相色谱高效液相色谱仪仪四四、高效液相色谱高效液相色谱分析方法分析方法high performance liquid chromatograph2023-1-27一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器 h
2、igh performance liquid chromatographhigh performance liquid chromatographhigh performance liquid chromatograph2023-1-27 概述概述概述 高效液相色谱法高效液相色谱法(high performance liquid chromatography;HPLC)是在60年代末,以经典液相色谱法为基础,引入了气相色谱的理论与实验方法,发展而成的分离分析方法。它与经典液相色谱法的主要区别是:流动相改为高压输送、采用高效固定相、具有在线检测器、仪器化。2023-1-27二、二、二、二、二、二
3、、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 feature of HPLCfeature of HPLCfeature of HPLC 特点:高压、高效、高速特点:高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2023-1-27一、一、一、一、一、一、HPLCHPLCHPLC与经典与经典与经典与经典与经典与经典LCLCLC区别区别区别区别区别区别 经典LC 与HPLC的主要区别:固定相差别,输液设备和检测手段1经典LC:仅做为一种分离手段 柱内
4、径13cm,固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低(H,n)分析周期长 无法在线检测2HPLC:分离和分析 柱内径26mm,固定相粒径8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子3)适用:极弱酸碱物质 pH=37弱酸;pH=78弱碱;两性化合物2023-1-273 3 3、容量因子及其影响因素容量因子及其影响因素容量因子及其影响因素 组分为弱酸时:流动相pHpKa,k值变小,tR 减小。组分为弱碱:流动相pHpKb,k值增大,tR增大;流动相pHpKb,k值变小,tR 减小。流动相的pH需在28之间,超出此范围可能使键合基团脱落。实验后,应及时用不含缓冲盐的流动相冲洗,以
5、防腐蚀仪器流路系统。2023-1-274 4 4、用途用途用途 有机弱酸、弱碱与两性化合物的分离,以及它们与分子型化合物共存时的分离。不适用于pka8.0的碱。离子抑制色谱法与离子对色谱法比较ISCPICpka3.0的酸pKa 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2023-1-275.5.5.5.5.5.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题(1)
6、尽量使用高纯度试剂作流动相,防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。(2)避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失;酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。(3)试样在流动相中应有适宜的溶解度,防止产生沉淀并在柱中沉积。(4)流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时,流动相不应有紫外吸收。2023-1-27一一一)流动相对分离的影响流动相对分离的影响流动相对分离的影响 高效液相色谱中,良好的固定相容易获得,改善分离效果主要是靠选择流动相。主要受溶剂种类的影响;k主要取决于溶剂的配比。22114kknR2023-1-27二二二)溶剂的强度和选择性溶剂的强度和选
7、择性溶剂的强度和选择性 1.溶剂的极性和强度 2.混合溶剂的强度 3.溶剂的选择性2023-1-27SnyderSnyderSnyder溶剂分类法溶剂分类法溶剂分类法 样品组分、溶剂与固定相三者间的作用力为分子间作用力,组分的分配系数由三者的分子间作用力所决定。分子间的作用力可分为以下三类:质子受体作用力 参照物:乙醇 质子给予作用力 参照物:二氧六环 强偶极作用力 参照物:硝基甲烷 选择以上作用力最强的常用溶剂作为参照,将81种常用溶剂分为八类。2023-1-27SnyderSnyderSnyder溶剂分类法溶剂分类法溶剂分类法 选择不同组别的溶剂,分子间作用力不同,容易造成组分间的分配系数
8、的差别,使改变,以利于组分的分离。根据各类参照物推算出常用溶剂的极性参数P/和反相洗脱溶剂的强度因子S值。选择不同极性参数P/的溶剂(正相)或不同强度因子S的溶剂(反相)进行配比,优化分离效果。2023-1-27三三三)溶剂最优方法溶剂最优方法溶剂最优方法-四面体优化法四面体优化法四面体优化法 根据色谱类型(正、反相)组成四面体;寻找被分离组分的容量因子k=3的等洗脱面ABC;将此等洗脱面视为正三角形按比例配制等洗脱强度的初试溶剂。用初试溶剂作为流动相,进样,检查分离效果,选择最好的溶剂系统。2023-1-27色谱溶剂系统的四面体优化法色谱溶剂系统的四面体优化法色谱溶剂系统的四面体优化法ABC
9、0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0.33/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.67BDB/A/C/AC2023-1-27应用实例应用实例应用实例 11种磺胺混合物的分离 组成溶剂四面体甲醇、乙腈、四氢呋喃底剂:水B水乙腈甲醇四氢呋喃AC2023-1-27应用实例应用实例应用实例 11种磺胺混合物的分离寻找等洗脱强度面用ODS键合相柱与甲醇-水,分离上述混合物。经数次调整配比,在甲醇-水(20.0:80.0)时,样品中保留时间适中组分的k=3(或25)。tR=t0(1+k)该号溶剂强度因子:Sab=3.00.2+
10、00.8=0.6所有配比溶剂系统的强度因子都为0.6。2023-1-27应用实例应用实例应用实例 11种磺胺混合物的分离MeOH-H2OCAN-H2OTHF-H2O0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0.33/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.67v按比例配制等洗脱强度的初试溶剂2023-1-27应用实例应用实例应用实例1)MeOH-H2O(20:80)2)CAN-H2O(18.8:81.2)3)THF-H2O(13.3:86.7)4)MeOH-CAN-H2O(10.0:9.4:80.6)5)ACN-THF-H2
11、O(9.4:6.6:84.0)6)MeOH-THF-H2O(10.0:6.6:83.4)7)MeOH-CAN-THF-H2O(6.7:6.3:4.4:82.6)MeOH-H2OCAN-H2OTHF-H2O0.5/0.5/00.5/0/0.50/0.5/0.50.33/0.33/0.330.67/0.16/0.160.16/0.67/0.160.16/0.16/0.672023-1-27应用实例应用实例应用实例 11种磺胺混合物的分离 用初试溶剂作为流动相,进样,检查分离效果 最佳流动相:MeOH-CAN-THF-H2O (6.7:6.3:4.4:82.6)2023-1-27洗脱方式洗脱方式洗脱
12、方式 恒组成溶剂洗脱用恒定配比的溶剂系统洗脱 梯度洗脱在一个分析周期内,按一定程序不断改变流动相的浓度配比。优点:缩短分析周期;提高分离效果;改善峰形;增加检测灵敏度。缺点:有时引起基线漂移;重复性不佳。2023-1-27续前续前续前 1)等度洗脱(恒组成溶剂洗脱)以固定配比的溶剂系统洗脱组分(一个泵)类似GC的等温度洗脱2)梯度洗脱:在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性(两个泵)适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温(沸程较长样品)2023-1-27三、分离条件的选择三、分离条件的选择三、分离条件的选择1 22114kknRuCAH流动相采用粘度小、低流速
13、的匀的固定相:采用粒度小、填充均n12121212RRRRVVttkkKK温影响小)质和固定相性质(受柱:调整流动相种类、性0ttVVKVCVCWWkRmsmmssms小)的配比(受柱温影响较:调整流动相和固定相k2023-1-27影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素 factors influenced separationfactors influenced separationfactors influenced separation1.1.影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气
14、体的万分之一,则速率方程中的分子扩散项B/U较小,可以忽略不计,即:H=A+C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同,如图所示。2023-1-27 液体的黏度比气体大一百倍,密度为气体的一千倍,故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程,降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中,不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。2023-1-27 2.2.2.2.2.2.流速流速流速流速流速流速 流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速,柱效提高不是很大。但在实际操作中,流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。3.3.固
15、定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱,其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中,分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作,一般很少自行制备。2023-1-27一一一)高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论(填充柱):uCuBAHGC/(毛细管柱)或uCuBH/dpA2dpAgmDDB22gRDBtB,MTDTDgg或llgsmCCCCCCllDdfC2TDL1.2023-1-27一一一)高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论高效液相色谱法的速率理论 HPLC是将LC与GC基本原理和实验方法相结合而产生。两者主要差别
16、是流动相性质不同 Van Deemter方程式:GC H=A+B/u+Cu 毛细管开口柱 H=B/u+Cu HPLC H=A+Cu (流动相是液体,粘度比气体大的多,柱温为室温,而且流速至少是最佳流速的3-5倍,综上原因可忽略纵向扩散项)2023-1-27图示图示图示back2023-1-27影响影响影响HPLCHPLCHPLC色谱峰宽的因素色谱峰宽的因素色谱峰宽的因素 涡流扩散项AA=2dp 降低固定相直径dp(3-5m)降低。采用球形、仄粒度分布(RSD5%)固定相及匀浆装柱。2023-1-27影响影响影响HPLCHPLCHPLC色谱峰宽的因素色谱峰宽的因素色谱峰宽的因素 纵向扩散项 纵向
17、扩散系数:因流动相黏度大,组分的纵向扩散系数很小,纵向扩散项可以忽略.uCAHHPLC:mDB2TDm相忽略大低,流动相柱温BT2023-1-27影响影响影响HPLCHPLCHPLC色谱峰宽的因素色谱峰宽的因素色谱峰宽的因素 传质阻抗系数C GC C=Cs HPLC C=Cm+Csm+Cs 化学键合相,固定液为键合在载体表面的官能团的单分子层 HPLC C=Cm+Csm Van deemter方程在HPLC中的表现形式:HPLC H=A+Cmu+Csmu2023-1-27续前续前续前3)传质阻抗项及其影响)(忽略固定相传质阻抗smmssmmCCCCCC忽略固定相传质阻抗态流动相的传质阻抗注:只
18、考虑流动相和静uCuCAHHPLCsmm:msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效,nHCdp柱效,nHDm,柱阻,但易产生气泡mmDTCDT2023-1-272023-1-27HPLCHPLCHPLC分离条件的选择分离条件的选择分离条件的选择 采用小粒度、仄分布的球形固定相,首选化学键合相,用匀浆法装柱。采用低粘度流动相,低流量(1ml/min)。柱温以25为宜。太低,则使流动相的粘度增加。用水溶液为流动相的色谱法(如IEC)可按需升温。2023-1-27其他其他其他(自学自学自学)正相键合相色谱的分离条件 反相键合相色谱的分离条件 反相离子对色谱的分离条件2023-1-27四四四 其他固
19、定相其他固定相其他固定相(自学自学自学)键合型离子交换剂 手性固定相 亲合色谱固定相2023-1-27五、分离类型选择五、分离类型选择五、分离类型选择五、分离类型选择五、分离类型选择五、分离类型选择 choice of separation typeschoice of separation typeschoice of separation types2023-1-27第二第二第二第二第二第二十十十十十十章章章章章章高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法一、一、输液系统输液系统二、二、分离与进样系统分离与进样系统三、检测系
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