医科大学精品课件：基因组DNA提取（7年制） (2).ppt

1、基因组基因组DNA的提取的提取 原原 理理 细胞裂解液细胞裂解液裂解组织匀浆裂解组织匀浆 蛋白酶蛋白酶K去去除除DNA结合结合蛋白蛋白 RNase去除去除RNA 饱和酚、酚饱和酚、酚/氯仿纯化氯仿纯化DNA 无水乙醇沉淀获得无水乙醇沉淀获得DNA DNA溶解于溶解于TE溶液溶液 70%乙醇乙醇洗涤洗涤DNA、干燥、干燥 琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定 实验步骤实验步骤 1、小鼠颈椎脱臼处死，取绿豆大小鼠颈椎脱臼处死，取绿豆大肝组织肝组织，放入匀浆，放入匀浆 器，加入器，加入10倍体积倍体积TE于冰浴中匀浆后，分装至于冰浴中匀浆后，分装至 1.5ml EP管中（管中（400 l/支）支）。

2、 2、加入、加入10% SDS至终浓度为至终浓度为0.5%（20 l）。）。 3、加入、加入RNase A (10mg/ml)至终浓度为至终浓度为20 g/ml（1 l）混匀，置）混匀，置37水浴水浴60min。 4、加入加入蛋白酶蛋白酶K（20mg/ml）至终浓度为）至终浓度为100 g/ml (2 l)混匀，混匀，55 水浴水浴2小时。小时。 5、冷却至室温，加等体积、冷却至室温，加等体积饱和酚饱和酚（450 l）充分颠）充分颠 倒混匀，倒混匀，12000rpm离心离心5min。 6、吸取上层水相移至另一干净、吸取上层水相移至另一干净EP管中，加入等体管中，加入等体 积积酚酚/氯仿氯仿，颠

3、倒混匀，颠倒混匀，12000rpm离心离心5min。 7、吸取上清移至另一干净吸取上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入0.2倍体积倍体积 5M KAc和和2倍体积倍体积冷无水乙醇冷无水乙醇混匀，静置混匀，静置5分钟，分钟， 12000rpm离心离心5min。 8、弃上清，用、弃上清，用0.5ml 70% 乙醇乙醇洗涤洗涤DNA，弃上清，弃上清， 倒置干燥。倒置干燥。 9、 加入加入10 l TE溶解溶解DNA。 10、加入、加入2 l 6loading buffer，充分混匀，充分混匀，1%琼琼 脂糖凝胶电泳鉴定。脂糖凝胶电泳鉴定。 蛋白酶蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋是一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋 白质和脂类物质，能使核蛋白降解成小片段并从白质和脂类物质，能使核蛋白降解成小片段并从 DNA上解离下来。上解离下来。 KAc增加盐离子浓度，使增加盐离子浓度，使DNA充分沉淀充分沉淀 基因组基因组DNA提取提取，抑制，抑制DNase活力很容易，但防止机活力很容易，但防止机 械剪切力拉断更为重要。械剪切力拉断更为重要。 用用EDTA、Dnase抑制剂、蛋白变性剂、去垢剂等都抑制剂、蛋白变性剂、去垢剂等都 可以使可以使DNase 失活。失活。