高效液相色谱仪的原理及应用课件.ppt

1、一、高效液相色谱法的定义和分类一、高效液相色谱法的定义和分类流动相是液体的色谱称为液相色谱（流动相是液体的色谱称为液相色谱（LC）。）。在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器完成，这种色谱称为高部工作通过仪器完成，这种色谱称为高效液相色谱效液相色谱（HPLC）。第一节第一节 高效液相色谱法原理高效液相色谱法原理一、高效液相色谱法的定义和分类一、高效液相色谱法的定义和分类液相色谱：平板色谱和柱色谱。液相色谱：平板色谱和柱色谱。液相色谱：分配色谱、液固色谱、离子交换液相色谱：分配色谱、液

2、固色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱。色谱、尺寸排阻色谱。气相色谱：挥发性物质，不能用于热不稳定气相色谱：挥发性物质，不能用于热不稳定物质分析。物质分析。液相色谱：可分析各种物质，热不稳定物质液相色谱：可分析各种物质，热不稳定物质，但流动相有毒，运行操作比，但流动相有毒，运行操作比GC难。能用难。能用GC就用就用GC。二、液相色谱中常用术语和参数二、液相色谱中常用术语和参数只针对只针对HPLC特有的，其余术语与第三章同特有的，其余术语与第三章同。粒间体积（粒间体积（V0）：色谱柱填充剂颗粒间隙中）：色谱柱填充剂颗粒间隙中流动相所占有的体积。流动相所占有的体积。孔体积孔体积（Vp）：色谱柱中多孔填

3、充剂的所：色谱柱中多孔填充剂的所有孔洞中流动相所占有的体积。有孔洞中流动相所占有的体积。二、液相色谱中常用术语和参数二、液相色谱中常用术语和参数柱外体积（柱外体积（Vext）：从进样系统到检测器之）：从进样系统到检测器之间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的体积。体积。液体总体积液体总体积（Vtot）：粒间体积、孔体积和：粒间体积、孔体积和柱外体积之和。柱外体积之和。淋洗体积淋洗体积（V）：从进样开始计算的通过色：从进样开始计算的通过色谱柱的实际淋洗体积。谱柱的实际淋洗体积。三、反相高效液相色谱三、反相高效液相色谱 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相由

4、非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配。溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配。溶质在吸附于填料表面烃类上的溶质在吸附于填料表面烃类上的“改良固定相改良固定相”和流动相之间进行分配和流动相之间进行分配溶质被吸附于填料表面烃类分子上，类似吸附溶质被吸附于填料表面烃类分子上，类似吸附色谱。色谱。四、正相高效液相色谱四、正相高效液相色谱

5、是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相己烷。吸附色谱也属正相HPLC。溶剂洗脱强度近似地随溶剂的介电常数增加溶剂洗脱强度近似地随溶剂的介电常数增加而增大，洗脱能力越弱，溶质在柱上保留时而增大，洗脱能力越弱，溶质在柱上保留时间越长。间越长。第二节第二节 高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪的组成Agilent 11001.输液系输液系统统2.进样系进样系统统3.分离系分离系统统4.检测系检

6、测系统统5.数据处数据处理理 系统系统一一 高效液相色谱仪系统高效液相色谱仪系统高压泵高压泵流动相溶剂流动相溶剂废液废液色谱柱色谱柱进样口进样口检测器检测器1 1、输液系统、输液系统 贮液装置贮液装置 脱气装置脱气装置高压输液泵高压输液泵梯度淋洗系统梯度淋洗系统输液系统的功能输液系统的功能:1.提供足够的驱动力使流动相通过填充柱提供足够的驱动力使流动相通过填充柱 2.使流动相流量精确和稳定使流动相流量精确和稳定 3.使流动相组成精确使流动相组成精确 分析用高效液相色谱的流动相贮罐，常分析用高效液相色谱的流动相贮罐，常用用1L的锥形瓶加一个电磁搅拌器，在连接的锥形瓶加一个电磁搅拌器，在连接到泵入

7、口处的管线上要加一个过滤器。到泵入口处的管线上要加一个过滤器。(1)贮液装置贮液装置 2）柱温在40左右，最高使用温度为50样品经过提取、皂化以及柱层析净化，除去脂肪类物质、色素等杂质后，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环芳烃物质中分离出来。柱外体积（Vext）：从进样系统到检测器之间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的体积。溶剂洗脱强度近似地随溶剂的介电常数增加而增大，洗脱能力越弱，溶质在柱上保留时间越长。现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；按流动相组成分：单组分和多组分；第一节 高效液相色谱法原理是当今液相色谱的最主要分离模式。硅氧硅碳键型：SiOSi C脱气机、超声脱气

8、、真空脱气等。稠环芳烃多为致癌物质。第一节 高效液相色谱法原理水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)色谱柱 填料现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。(2)检测器：荧光检测器，激发波长369nm，荧光波长405nm。流速：2mLmin。（2）表面多孔型担体流速：2mLmin。(3)样品的测定：在上述实验条件下，吸取一定量经过柱净化的样品提取液，注入液相色谱仪中进行分离、分析，测得峰面积，然后从标准

9、曲线上查出相应于此面积的苯并芘含量。二、液相色谱中常用术语和参数(2)脱气装置脱气装置 用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。气装置再输送到色谱柱。脱气机、超声脱气、真空脱气等。脱气机、超声脱气、真空脱气等。(3)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙乙酸乙酯酸乙酯 乙醚乙醚

10、异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)1 1、环境中有机氯农药残留量分析、环境中有机氯农药残留量分析 固定相固定相：薄壳型硅胶薄壳型硅胶(37 50 m)流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径)检测器：折光示差检测器检测器：折光示差检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。残留量进行分析。第三节第三节 HPLC的应用的应用2、稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。稠环芳烃多为致癌物质。固定相固定相：十八烷基硅

11、烷化键合相十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水 100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器例：液相色谱法测定食品中苯并例：液相色谱法测定食品中苯并(a)芘芘原理：原理：样品经过提取、皂化以及柱层析净化，除去脂肪类物质、色样品经过提取、皂化以及柱层析净化，除去脂肪类物质、色素等杂质后，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环素等杂质后，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环芳烃物质中分离出来。求出样品中苯并芘的含量。芳烃物质中分

12、离出来。求出样品中苯并芘的含量。仪器：仪器：(1)液相色谱仪：液相色谱仪：色谱柱：色谱柱：ODS柱，柱长柱，柱长250mm，4mm；柱温：柱温：30；流动相：流动相：75甲醇；甲醇；流速：流速：2mLmin。(2)检测器：荧光检测器，激发波长检测器：荧光检测器，激发波长369nm，荧光波长荧光波长405nm。操作步骤：操作步骤：(1)定性测定定性测定 用微量注射器吸取一定量的苯并芘标准溶液和用微量注射器吸取一定量的苯并芘标准溶液和样液，注入色谱仪内，根据苯并芘的出峰保留时间和样品中加样液，注入色谱仪内，根据苯并芘的出峰保留时间和样品中加标准样产生重叠的情况进行定性。标准样产生重叠的情况进行定性

13、。(2)标准曲线的绘制标准曲线的绘制 用微量注射器准确吸取每用微量注射器准确吸取每1mL含含1g的的苯并芘标准溶液苯并芘标准溶液1、2、3、4、5uL按照上述实验条件进行操作，按照上述实验条件进行操作，以获得相应的色谱图。然后，分别测量各个色谱的峰面积。以以获得相应的色谱图。然后，分别测量各个色谱的峰面积。以峰面积为纵坐标，标准苯并芘量为横坐标，绘制标准曲线。峰面积为纵坐标，标准苯并芘量为横坐标，绘制标准曲线。(3)样品的测定：样品的测定：在上述实验条件下，吸取一定量经过柱净在上述实验条件下，吸取一定量经过柱净化的样品提取液，注入液相色谱仪中进行分离、分析，测得峰化的样品提取液，注入液相色谱仪

14、中进行分离、分析，测得峰面积，然后从标准曲线上查出相应于此面积的苯并芘含量。面积，然后从标准曲线上查出相应于此面积的苯并芘含量。Waters 515高效液相色谱泵，高效液相色谱泵，Waters 717自动进样器，自动进样器，Waters 2487双波长紫外检测器，双波长紫外检测器，联想数据处理机，联想数据处理机，Waters 3.9 X 150 mm C18不锈钢柱不锈钢柱流动相：甲醉、水体积比流动相：甲醉、水体积比30：70 和和15：85两种，两种，超声波除气泡超声波除气泡3、鱼组织中喹乙醇残留量的检测无喹乙醇的鲤肌肉无喹乙醇的鲤肌肉喹乙醇标准品喹乙醇标准品含喹乙醇的鲤肌肉含喹乙醇的鲤肌肉4、中药质量检测芍药苷芍药苷白芍药材白芍药材血竭素血竭素 血竭药材血竭药材作业作业 P73 2