血红蛋白的提取和分离(shk)课件.ppt
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- 血红蛋白 提取 分离 shk 课件
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1、血红蛋白的提取和别离血红蛋白的提取和别离(shk)第一页,共66页。学习目的 简述蛋白质提取和别离的根本原理,并理解凝胶色谱法、电泳法等别离生物大分子的根本原理。1、主要概念:凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.主要原理:凝胶色谱法别离蛋白质的原理 电泳法别离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点:凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点:样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。2021/1/122第二页,共66页。2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代。人类基因组:指DNA分子所携带的全部遗传信息。蛋
2、白质组:生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。对蛋白质的研究和应用,首先需要获得纯度较高的蛋白质。如何从复杂的细胞混合物中提取,别离高纯度的蛋白质呢?2021/1/123第三页,共66页。考虑1 别离生物大分子的根本思路是什么?选用一定的物理或化学的方法别离具有不同物理或化学性质的生物大分子。考虑2 蛋白质的别离和提取的原理是什么?根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来别离不同蛋白质。你认为别离蛋白质和别离DNA一样容易吗?2021/1/124第四页,共66页。考虑3 人们用鸡的红细胞提取DN
3、A,用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于进展DNA的提取,人的红细胞无细胞核,构造简单,血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。2021/1/125第五页,共66页。提取提取分离分离方法方法凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 别离蛋白质的方法:2021/1/126第六页,共66页。一、根底知识 凝胶色谱法分配色谱法:1、凝胶:一些微小多孔的球体内含许多贯穿的通道,由多糖类化合物构成如葡聚糖、琼脂糖,具多孔的凝胶就叫分子筛 2、概念:根据被别离的蛋白质相对分子质量的大小,利用具有网状构造的凝胶的分子筛作用,来进展别离。2021/1/127第七页,共66
4、页。3、原理:当不同的蛋白质通过凝胶时,的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程 ,挪动速度 ,而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在 挪动,路程 ,挪动速度 ,相对分子质量不同的蛋白质因此得以别离。4、详细过程相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快2021/1/128第八页,共66页。2021/1/129第九页,共66页。2021/1/1210第十页,共66页。1、概念:在一定的范围内,能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液:2、作用:可以抵抗 对溶液的 的影响,维持PH根本不变。外界的酸或碱
5、PH值2021/1/1211第十一页,共66页。3、缓冲溶液的配制通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液。12使用比例在不同PH范围内 考虑:说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO32021/1/1212第十二页,共66页。电泳:1、概念:指带电粒子在电场作用下发生 迁移的过程。考虑:在整个实验过程中使用的缓冲液是什么?它的目的是什么?使用的是磷酸缓冲液,目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境,保证血红蛋白的正常构造和功能,便于观察红色和材料的科学研究活性。2021/1/1213第十三页,共66页。2、原理:许多重要的生
6、物大分子,如 等都具有 )在()下,这些基团会带上 。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其 挪动。电泳利用了待别离样品中各种分子 以及分子本身 、的不同使带电分子产生不同的 ,从而实现样品中各种分子的别离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度 一定的PH2021/1/1214第十四页,共66页。2021/1/1215第十五页,共66页。1聚丙稀酰胺凝胶:是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂四甲基已二胺的作用下聚合交联成三维网状构造的凝胶 3.分类:两种常用的电泳方法:琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺
7、凝胶电泳:蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。2原理 2021/1/1216第十六页,共66页。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中参加()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链,因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因此掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异,使电泳迁移率完全取决于()。3SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:单条肽链的分子量分子的大小SDS注意:测定 通常用十二烷基磺酸钠SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对
8、分子质量2021/1/1217第十七页,共66页。聚丙烯酰胺凝胶电泳对别离大分子具有较高的分辨率,但核酸比蛋白质分子大得多,只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根,核酸带负电荷,在电场中向正极挪动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下,发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置,可以用在对PCR扩增效果的鉴定上。说明:2021/1/1218第十八页,共66页。电泳检测PCR结果2021/1/1219第十九页,共66页。二、实验操作 蛋白质的提取和别离一般分为四步:1.样品处理:包括洗涤红细胞;血红蛋白稀释;离心等操作搜集到血红蛋白溶液。2.粗别离:透析除去分子
9、较小的杂质。3.纯化:通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。4.纯度鉴定:通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。2021/1/1220第二十页,共66页。二 实验操作血液血浆水分其他物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞最多血红蛋白 两个a肽链两个一肽链共四条肽链902021/1/1221第二十一页,共66页。2021/1/1222第二十二页,共66页。2021/1/1223第二十三页,共66页。每个肽链环绕一个亚铁血红素基团,此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳,血红蛋白因含有血红素而呈红色。2021/1/1224第二十四页,共66页。目的:去除 方法:离心速度越高和时间越长会使
10、白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到别离的效果,然后用胶头吸管吸出上层透明的 ,将下层 的红细胞液体倒入 每个肽链环绕 ,此基团可携带 。血红蛋白因含有 而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来别离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳血红素(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色烧杯2021/1/1225第二十五页,共66页。再参加用 的 质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤,缓慢搅拌10min,离心.五倍体积生理盐水低速短时间如此重复洗涤 次,直至上清液中已没有 ,说明洗涤干净。利于后续血红蛋白的别离纯化,不可洗涤次数过少。三黄色2021/1/1226第二十六
11、页,共66页。洗涤过程图解血液100mL3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min2 min红细胞红细胞血浆血浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5 5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min10min重复洗涤3次,直至上清液没有黄色2021/1/1227第二十七页,共66页。(2)血红蛋白的释放 加 到 体积,再加40体积的 溶解细胞膜,置于 上充分搅拌10min加速细胞破裂,细胞破裂释放出血红蛋白.(3)别离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心管内,以2000r/min的速度离心10 min,试管中的溶液分为4层:原血液甲苯磁力搅拌器蒸馏水2021/1/1228第二十八页,共6
12、6页。第1层最上层:甲苯层第2层中上层:色薄层固体,的沉淀层。第3层中下层:的液体,的水溶液层。第4层最下层:其它杂质 的沉淀层无色透明脂溶性物质白血红蛋白红色透明暗红色2021/1/1229第二十九页,共66页。用 过滤,除去 ,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。滤纸脂溶性沉淀层2021/1/1230第三十页,共66页。别离血红蛋白别离过程红细胞混合液高速离心高速离心10min 10min 离心管离心管滤纸滤纸过滤过滤脂脂溶性沉淀溶性沉淀物物烧杯烧杯2021/1/1231第三十一页,共66页。取()ml的血红蛋白溶液装入 中,将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmo
13、l/L的 中,pH为 ,透析12小时,目的是 或用于更换样品中的 。透析袋一般用硝酸纤维素制成,又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质透析袋磷酸缓冲液缓冲液(4)透析粗别离12021/1/1232第三十二页,共66页。2021/1/1233第三十三页,共66页。小结:样品处理和粗别离n1、红细胞的洗涤:n目的是去除杂蛋白。要参加柠檬酸钠防止血液凝固;离心将血液分层,用胶头吸管吸出黄色血浆;用生理盐水洗涤。n2、血红蛋白的释放:n在蒸馏水和甲苯作用下,红细胞破裂释放n3、别离血红蛋白溶液:n离心分层;滤纸过滤去除脂溶性沉淀层;分液漏斗分出红色透明液体。n4、透析:n装入透析袋并置于磷酸缓冲液中P
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