医科大学精品课件：电泳技术.ppt

1、电泳技术电泳技术 一、概述一、概述 （一）定义（一）定义 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性 相反的电极移动，称为电泳相反的电极移动，称为电泳(electrophoxesis) （二）分类（二）分类 显微电泳显微电泳 自由界面电泳自由界面电泳 区带电泳区带电泳 区带电泳区带电泳 1. 按其支持物的物理性状不同可分为：按其支持物的物理性状不同可分为： （ 1）滤纸及其它纤维电泳）滤纸及其它纤维电泳 （2）凝胶电泳）凝胶电泳 （3）粉末电泳）粉末电泳 （4）线丝电泳）线丝电泳 2. 按支持物的装置形式不同按支持物的装置形式不同 （1）平板式电泳：）平板式电泳：

2、 （2）垂直板式电泳）垂直板式电泳 （3）垂直柱式电泳：）垂直柱式电泳： 3. 按按pH的连续性不同的连续性不同 （1）连续）连续pH电泳电泳 （2）非连续）非连续pH电泳电泳 （三）电泳的应用（三）电泳的应用 分离复杂高分子化合物如蛋白质、酶、核分离复杂高分子化合物如蛋白质、酶、核 酸等酸等 物质纯度分析物质纯度分析 结合其他层析法等分离技术可以提高对物结合其他层析法等分离技术可以提高对物 质的结构分析和鉴别能力质的结构分析和鉴别能力 电泳技术已成为生物化学与分子生物学的电泳技术已成为生物化学与分子生物学的 科学研究的重要工具。科学研究的重要工具。 二、电泳原理 （一）任一物质的分子，由于其

3、本身基团（一）任一物质的分子，由于其本身基团 的解离作用或由于表面吸附有其他带电基的解离作用或由于表面吸附有其他带电基 团，都可成为带电颗粒。团，都可成为带电颗粒。 例如：蛋白质分子是两性电解质，在一定例如：蛋白质分子是两性电解质，在一定 的的pH条件下，就会解离而带电。带电的性条件下，就会解离而带电。带电的性 质和多少决定于蛋白质分子的性质质和多少决定于蛋白质分子的性质(pI)及溶及溶 液的液的pH值和离子强度。值和离子强度。 PH PIPH PI 在电场中在电场中 负极负极 不动不动 正极正极 运动方向运动方向 迁移率迁移率 不同带电颗粒其电荷量不同，在电场中泳动不同带电颗粒其电荷量不同，

4、在电场中泳动 速度不同。带电颗粒在单位电场强度下的泳速度不同。带电颗粒在单位电场强度下的泳 动速度称为迁移率动速度称为迁移率(m)。 即即mv/E，式中，式中E为电场强度，为电场强度，v为颗粒电为颗粒电 泳速度。泳速度。 迁移率是带电颗粒的迁移率是带电颗粒的个物理常数。个物理常数。 (二二)影响电泳的因素影响电泳的因素 1带电颗粒的物理性状带电颗粒的物理性状 2支持物介质支持物介质 3缓冲溶液缓冲溶液 4电场强度电场强度 1带电颗粒的物理性状带电颗粒的物理性状 包括带电颗粒电荷数，颗粒大小、形状和空间构包括带电颗粒电荷数，颗粒大小、形状和空间构 型。型。 在电场中，带电颗粒所受的作用力在电场中

5、，带电颗粒所受的作用力(F)与电场强度与电场强度 (E)，带电颗粒的净电荷量，带电颗粒的净电荷量(Q)有关：有关：F=EQ； 带电颗粒在泳动时受到的阻力带电颗粒在泳动时受到的阻力 (F)与带电颗粒的半与带电颗粒的半 径径(r)，溶液的粘度，溶液的粘度()有关，有关，F=6 r ， 当两种相反作用的力达到平衡时当两种相反作用的力达到平衡时FF，则，则EQ 6即：即：mv/E=Q/6。 带电颗粒电荷量愈多，电泳速度越快，颗粒形状带电颗粒电荷量愈多，电泳速度越快，颗粒形状 越大，与支持物介质摩擦越大，电泳速度越小。越大，与支持物介质摩擦越大，电泳速度越小。 2支持物介质支持物介质 （1）吸附作用）吸

6、附作用 支持物对样品的滞留作用，造成拖尾而降低分辨力。支持物对样品的滞留作用，造成拖尾而降低分辨力。 （2）电渗作用）电渗作用 多孔支持物表面可吸附水中的正或负离子使溶液相对多孔支持物表面可吸附水中的正或负离子使溶液相对 带电，在电场作用下，溶液就会向一定方向移动，这带电，在电场作用下，溶液就会向一定方向移动，这 种在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象称种在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象称 为电渗。为电渗。 若电渗作用的方向和电泳作用的方向一致，则物质移若电渗作用的方向和电泳作用的方向一致，则物质移 动是电渗和电泳作用之和，反之是二者作用之差。动是电渗和电泳作用之和，反之是二者

7、作用之差。 （3）分子筛作用）分子筛作用 凝胶支持物结构的孔隙对带电颗粒分子产生阻力，分凝胶支持物结构的孔隙对带电颗粒分子产生阻力，分 子大的在凝胶中泳动速度慢，分子小的泳动速度快子大的在凝胶中泳动速度慢，分子小的泳动速度快 。 3缓冲溶液缓冲溶液 缓冲溶液是电泳中的导体，它的种类、缓冲溶液是电泳中的导体，它的种类、pH值、离子强度直接影响电泳值、离子强度直接影响电泳 的效率。的效率。 pH值：值：决定带电颗粒解离的程度，对蛋白质两性电解质而言，决定带电颗粒解离的程度，对蛋白质两性电解质而言，pH值值 离离pI越远，则颗粒净电荷越多，泳动速度越快，反之则越慢，因此应选越远，则颗粒净电荷越多，泳

8、动速度越快，反之则越慢，因此应选 择合适的择合适的pH，使各种蛋白质所带电荷差异较大，有利于彼此分开，为了，使各种蛋白质所带电荷差异较大，有利于彼此分开，为了 使电泳过程溶液使电泳过程溶液pH值恒定，必须采用具有一定缓冲能力的缓冲溶液。值恒定，必须采用具有一定缓冲能力的缓冲溶液。 离子强度：离子强度：离子强度影响颗粒的电动电势，溶液的离子强度越高，离子强度影响颗粒的电动电势，溶液的离子强度越高， 电动电势越小，则电泳速度越慢，反之，则越快，一般最适的离子强度电动电势越小，则电泳速度越慢，反之，则越快，一般最适的离子强度 在在0.020.2之间，计算方法为：之间，计算方法为：I=12CZ2 (式

9、中：式中：I为离子强度，为离子强度，C为为 离子的摩尔浓度，离子的摩尔浓度，Z为离子的价数为离子的价数)。离子强度过低，溶液的缓冲能力减。离子强度过低，溶液的缓冲能力减 弱，不易维持所需弱，不易维持所需pH值，反而会影响颗粒带电荷状态影响电泳。值，反而会影响颗粒带电荷状态影响电泳。 4电场强度电场强度 电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降，电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降， 也称电势梯度。也称电势梯度。 电场强度对电泳速度起着决定性作用，电电场强度对电泳速度起着决定性作用，电 场强度越高，电泳速度越快，但随着电压场强度越高，电泳速度越快，但随着电压 的增加，电流加大，产生热效应，易使蛋的增

10、加，电流加大，产生热效应，易使蛋 白质变性而改变性质影响电泳。进行高压白质变性而改变性质影响电泳。进行高压 电泳应配备冷却水系统以便在电泳过程中电泳应配备冷却水系统以便在电泳过程中 降温。降温。 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、聚丙烯酰胺凝胶的性能一、聚丙烯酰胺凝胶的性能 聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性，透聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性，透 明，相对化学稳定，对明，相对化学稳定，对pH和温度变化较稳和温度变化较稳 定，在很多溶剂中不溶，没有吸附和电渗作定，在很多溶剂中不溶，没有吸附和电渗作 用。原料成分要采用高纯度制品，通过调节用。原料成分要采用高纯度制品，通过调节 单体的浓

11、度和交联度可以控制孔径大小，制单体的浓度和交联度可以控制孔径大小，制 备凝胶的重复性好。备凝胶的重复性好。 二、聚丙烯酰胺凝胶制备原理二、聚丙烯酰胺凝胶制备原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acr)和少量和少量 的交联剂甲叉双丙烯酰胺的交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)，在催化剂的作，在催化剂的作 用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种： 化学聚合化学聚合 采用过硫酸铵为催化剂，四甲基乙二采用过硫酸铵为催化剂，四甲基乙二 胺胺(TEMED)为加速剂，在为加速剂，在

12、TEMED作用下，过硫酸作用下，过硫酸 铵形成自由基铵形成自由基SO4-，后者可使丙烯酰胺单体的双键，后者可使丙烯酰胺单体的双键 打开，活化形成自由基丙烯酰胺，从而引起聚合作打开，活化形成自由基丙烯酰胺，从而引起聚合作 用。用。 光聚合光聚合 用核黄素作催化剂，核黄素在光照下用核黄素作催化剂，核黄素在光照下 分解成无色基，后者再被氧化成自由基而引发聚合分解成无色基，后者再被氧化成自由基而引发聚合 作用。日光灯光源、直接日光或室内强散射光均可，作用。日光灯光源、直接日光或室内强散射光均可， 当加入当加入TEMED后能促进聚合。光聚合形成的凝胶后能促进聚合。光聚合形成的凝胶 孔径较大孔径较大(大孔

13、径大孔径)，且随时间的延长而逐渐变小，且随时间的延长而逐渐变小， 不太稳定，多用于制备浓缩胶。不太稳定，多用于制备浓缩胶。 三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系 凝胶浓度（凝胶浓度（T）：）：是指是指100ml凝胶中含凝胶中含Acr和和Bis的的 总克数。总克数。 交联度（交联度（C）：）：是指是指Bis占凝胶总克数的。占凝胶总克数的。 T愈大则胶愈硬也易脆裂，愈大则胶愈硬也易脆裂，T过小，则胶稀软不过小，则胶稀软不 易操作。易操作。 C过高不仅胶变脆缺乏弹性且透明度降低；过高不仅胶变脆缺乏弹性且透明度降低；C过过 低则胶聚合不良呈糊状。低则胶聚合不良呈糊状

14、。 Acr与与Bis量还影响胶的孔径大小，因此必须根据样量还影响胶的孔径大小，因此必须根据样 品分子的大小选择凝胶配方：一般情况下，体内蛋品分子的大小选择凝胶配方：一般情况下，体内蛋 白质多采用白质多采用75浓度凝胶，所得电泳结果是满意浓度凝胶，所得电泳结果是满意 的。的。 三、聚丙烯酰胺凝胶电脉原理三、聚丙烯酰胺凝胶电脉原理 聚丙烯酰胺凝胶管中具有聚丙烯酰胺凝胶管中具有23种不同的凝胶层，种不同的凝胶层， 最上层是样品层（或样品胶），中层是浓缩胶，最上层是样品层（或样品胶），中层是浓缩胶， 这两层均为大孔胶，用这两层均为大孔胶，用Tris-HCl缓冲液，缓冲液，pH值值6.7； 最下层是分离

15、胶（又称电泳胶），该层为小孔胶，最下层是分离胶（又称电泳胶），该层为小孔胶， 用用Tris-HCl缓冲液，缓冲液，pH值值8.9。 在上下两电泳槽中以在上下两电泳槽中以Tris-甘氨酸为缓冲液，甘氨酸为缓冲液，pH值值 8.3。这样造成凝胶层、缓冲液、。这样造成凝胶层、缓冲液、pH值及电场强值及电场强 度的不连续性，在这样的凝胶系统中存在三种效度的不连续性，在这样的凝胶系统中存在三种效 应：应：浓缩效应、电荷效应及分子筛效应浓缩效应、电荷效应及分子筛效应。 （一）浓缩效应（一）浓缩效应 在样品胶与浓缩胶中进行，这两层胶中含有在样品胶与浓缩胶中进行，这两层胶中含有Cl-、Pr- （蛋白质（蛋白质

16、 离子）和离子）和 CH2NH2COO- （甘氨酸离子）三种负离子。在缓冲（甘氨酸离子）三种负离子。在缓冲 液液pH值值6.7中中HCl几乎全部解离；而样品几乎全部解离；而样品 Pr的多数等电点的多数等电点PI为为 5左右，其解离度次之；甘氨酸的左右，其解离度次之；甘氨酸的PI为为6，其解离度最小。，其解离度最小。 通电后三者均向正极移动，但其有效迁移率通电后三者均向正极移动，但其有效迁移率()不同，不同，=m a （m：迁移率；：迁移率；：解离度），：解离度），mclcl m蛋 蛋蛋蛋m甘甘甘甘，电泳时 ，电泳时 Cl-泳动速度最快泳动速度最快(称快离子或前导离子称快离子或前导离子)：其次为

17、蛋白质，最慢：其次为蛋白质，最慢 的是甘氨酸离子的是甘氨酸离子(称慢离子或尾随离子称慢离子或尾随离子)。 由于由于C1-快速向正极移动，在它的后面形成一个离子浓度低的快速向正极移动，在它的后面形成一个离子浓度低的 低电导区，电导与电压梯度成反比，低电导区形成高电压梯低电导区，电导与电压梯度成反比，低电导区形成高电压梯 度。因度。因v E，于是使蛋白质和慢离子也紧跟快离子快移，于是使蛋白质和慢离子也紧跟快离子快移， 形成三种离子移动界面，蛋白质离子夹在中间，被浓缩成一形成三种离子移动界面，蛋白质离子夹在中间，被浓缩成一 薄层，如原来薄层，如原来lcm厚的样品层可被浓缩为厚的样品层可被浓缩为25m

18、的厚度。的厚度。 当夹在快离子和慢离子中间的蛋白质通过浓缩胶当夹在快离子和慢离子中间的蛋白质通过浓缩胶 进入分离胶时，进入分离胶时，pH值和凝胶孔径突然改变，分离值和凝胶孔径突然改变，分离 胶胶pH8.9（电泳时经实际测量是（电泳时经实际测量是9.5），接近于甘），接近于甘 氨酸的氨酸的pK2值值9.79.85，这样慢离子的解离度增，这样慢离子的解离度增 大，因而它的有效迁移率也增加，此时慢离子的大，因而它的有效迁移率也增加，此时慢离子的 有效迁移率超过了所有蛋白质的有效迁移率，从有效迁移率超过了所有蛋白质的有效迁移率，从 而赶上并超过所有蛋白质分子，这样，高电压梯而赶上并超过所有蛋白质分子，

19、这样，高电压梯 度不存在了，浓缩效应被破坏，蛋白质样品是在度不存在了，浓缩效应被破坏，蛋白质样品是在 一个均一的电压梯度和一个均一的电压梯度和pH条件下通过分离胶。条件下通过分离胶。 （二）电荷效应（二）电荷效应 在分离胶中进行，在高度浓缩的蛋白质薄在分离胶中进行，在高度浓缩的蛋白质薄 层中，由于各种蛋白质分子的层中，由于各种蛋白质分子的PI不同，所不同，所 带电荷不同，其迁移率也不同，各种蛋白带电荷不同，其迁移率也不同，各种蛋白 质就按迁移率的快慢顺序而分离。质就按迁移率的快慢顺序而分离。 （三）分子筛效应（三）分子筛效应 分子量或构型不同的蛋白质通过一定孔径分子量或构型不同的蛋白质通过一定

20、孔径 的分离胶时所受的摩擦力不同，受阻滞的的分离胶时所受的摩擦力不同，受阻滞的 程度不同。因此表现出不同的泳动率即所程度不同。因此表现出不同的泳动率即所 谓分子筛效应。谓分子筛效应。 即使静电荷相似，也就是说自由迁移率相即使静电荷相似，也就是说自由迁移率相 等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在 分离胶中被分开了。分离胶中被分开了。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH 一、目的一、目的 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳原理和方法，掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳原理和方法， 了解了解LDH同工酶分离方法同工酶分离方法 二、原理二、原理 乳酸脱氢酶（LDH）

21、及其同工酶是糖代谢 中的一种很重要的酶，它催化丙酮酸与乳 酸的相互转化。 LDH是发现最早又研究最多的具有同工酶的一组酶。是发现最早又研究最多的具有同工酶的一组酶。 由于同工酶的分子结构不同，电泳迁移率不同，因由于同工酶的分子结构不同，电泳迁移率不同，因 此电泳法可将其分开（聚丙烯酰胺凝胶电泳原理）。此电泳法可将其分开（聚丙烯酰胺凝胶电泳原理）。 LDH是由两种亚基（是由两种亚基（H亚基和亚基和M亚基）通过不同的亚基）通过不同的 组合形成四聚体，共有五种同工酶，组合形成四聚体，共有五种同工酶，LDH1、LDH2、 LDH3、LDH4、LDH5。这些同工酶在不同器官中。这些同工酶在不同器官中 的

22、分布及含量不同，各器官都有自己特定的同工酶的分布及含量不同，各器官都有自己特定的同工酶 谱。如心肌中谱。如心肌中LDHl活性最高，肝脏中活性最高，肝脏中LDH5活性最活性最 高。高。 正常情况下，血清中正常情况下，血清中LDH同工酶活性较低，多半来同工酶活性较低，多半来 自红细胞的渗出和释放，经电泳分离，可呈现特定自红细胞的渗出和释放，经电泳分离，可呈现特定 的同工酶谱。的同工酶谱。 同工酶的染色原理同工酶的染色原理 将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的同工酶凝胶条，加上将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的同工酶凝胶条，加上 酶的底物乳酸，则可催化底物脱氢生成丙酮酸。酶的底物乳酸，则可催化底物脱氢生成丙酮酸。 同

23、时生成还原型同时生成还原型NADH+H+，它可使吩嗪硫酸甲酯，它可使吩嗪硫酸甲酯 （PMS）还原，后者又使浅黄色的氯化硝基四氮唑）还原，后者又使浅黄色的氯化硝基四氮唑 蓝蓝(NBT)还原成蓝紫色，从而显示各同工酶区带。还原成蓝紫色，从而显示各同工酶区带。 其反应式如下：其反应式如下： 三、操作三、操作 1.凝胶溶液的配制 试剂 分离胶 浓缩胶 A液 1.8 B液 2.0 C液 0.7 D液 1.4 H2O 5.0 2.4 1%TEMED 0.5 0.2 1%过硫酸铵（用前加） 0.7 0.3 总体积 10.0 5.0 胶浓度 5.75% 3.5% 2凝胶管的制备凝胶管的制备 将洗净干玻璃管，一

24、端塞紧勿漏水且垂直固定之。将洗净干玻璃管，一端塞紧勿漏水且垂直固定之。 上表中分离胶溶液混合均匀后，即用细滴管吸出上表中分离胶溶液混合均匀后，即用细滴管吸出 加入垂直玻璃管中至加入垂直玻璃管中至34高度，再以细滴管小心地高度，再以细滴管小心地 在胶液上复盖在胶液上复盖0.5cm厚度的水层，静置约厚度的水层，静置约2030分钟分钟 后水与胶界面清晰，表明凝胶聚合完成，用滤纸屑后水与胶界面清晰，表明凝胶聚合完成，用滤纸屑 吸去复盖的水层，即为分离胶。吸去复盖的水层，即为分离胶。 浓缩胶（用前加入浓缩胶（用前加入10过硫酸铵过硫酸铵0.1m1)混匀后，混匀后， 用细滴管吸此液加入到已制成分离胶的玻璃

25、管上面用细滴管吸此液加入到已制成分离胶的玻璃管上面 约约1.2cm厚度，同样再复盖厚度，同样再复盖0.5cm厚的水层，玻管垂厚的水层，玻管垂 直静置至界面清晰为止；聚合后，用滤纸屑吸去水直静置至界面清晰为止；聚合后，用滤纸屑吸去水 层，即为浓缩胶与分离胶的玻管。层，即为浓缩胶与分离胶的玻管。 3样品配制样品配制 取正常血清取正常血清301，加，加005溴酚兰溴酚兰101， 加加20蔗糖液至蔗糖液至100l，混匀。即为含追踪，混匀。即为含追踪 剂的待测血清样品。剂的待测血清样品。 4加样加样 选择合格的凝胶管（无气泡、无裂缝、无剥离、选择合格的凝胶管（无气泡、无裂缝、无剥离、 聚合均匀），垂直插

26、入上层电极槽的橡胶孔中，聚合均匀），垂直插入上层电极槽的橡胶孔中， 下端浸入盛有电极缓冲液的下层电极槽中，赶走下端浸入盛有电极缓冲液的下层电极槽中，赶走 下端气泡。下端气泡。 各管垂直固定后，用注射器吸取少量电极缓冲液，各管垂直固定后，用注射器吸取少量电极缓冲液， 沿上端管壁小心加在浓缩胶上约沿上端管壁小心加在浓缩胶上约0.5cm厚度，再用厚度，再用 微量注射器取血清样品微量注射器取血清样品10301，伸入电极缓冲液，伸入电极缓冲液 中，沿管壁慢慢加在浓缩胶面上，不要激起电极中，沿管壁慢慢加在浓缩胶面上，不要激起电极 缓冲液，上槽添满电极缓冲液至缓冲液，上槽添满电极缓冲液至23高度，凝胶高度，

27、凝胶 管上下必须无气泡。管上下必须无气泡。 5电泳电泳 将上电泳槽接负极，下电泳槽接正极。接通将上电泳槽接负极，下电泳槽接正极。接通 电源，开始调节电流为电源，开始调节电流为12mA管，待追踪管，待追踪 剂进入分离胶时，电流可调到剂进入分离胶时，电流可调到35mA管，管， 待追踪剂接近管底待追踪剂接近管底0.5cm处切断电源。处切断电源。 6剥胶剥胶 取下凝胶管用带有长针头的注射器，盛满取下凝胶管用带有长针头的注射器，盛满 蒸馏水作湿润剂，将针头插入胶柱与管壁蒸馏水作湿润剂，将针头插入胶柱与管壁 之间，边注水，边旋转玻管，直至胶柱与之间，边注水，边旋转玻管，直至胶柱与 管壁分开，后用吸耳球轻轻

28、挤压，凝胶随管壁分开，后用吸耳球轻轻挤压，凝胶随 即滑出。即滑出。 7染色染色 染色液倒入装有凝胶的小试管中，将凝胶染色液倒入装有凝胶的小试管中，将凝胶 完全浸没，放入完全浸没，放入37恒温水浴中保温，约恒温水浴中保温，约 15min左右出现色带，待色带明显后，取出左右出现色带，待色带明显后，取出 小试管，弃去染色液，倒入蒸馏水，观察小试管，弃去染色液，倒入蒸馏水，观察 实验结果。实验结果。 LDH4 LDH3 LDH5 LDH1 LDH2 1 2 3 4 电泳结果实例电泳结果实例 实验报告实验报告 一、目的一、目的 二、原理（聚胶原理、电泳原理、染色原二、原理（聚胶原理、电泳原理、染色原 理）理） 三、操作三、操作 四、结果四、结果 绘制血清绘制血清LDH同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 图谱图谱 LDH3 LDH2 LDH1 溴酚蓝 + 血清血清LDH同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 _ I=35mA/管管, t=90min