酶组织化学课件.ppt

1、酶组织化学酶组织化学掌握内容掌握内容 酶组织化学的基本原理酶组织化学的基本原理 光镜酶组织化学的光镜酶组织化学的基本方法基本方法 几种重要的酶组织化学方法几种重要的酶组织化学方法概概 述述 酶的组织化学酶的组织化学 利用细胞内的酶具有利用细胞内的酶具有催化催化底物的特底物的特性，并通过性，并通过显色反应显色反应在切片或涂片上显示在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性组织或细胞中内源性酶的活性酶的活性及其定位的及其定位的方法方法 特点：特点：在原位检测在原位检测 检测酶的活性而不是酶分子本检测酶的活性而不是酶分子本身身酶组织化学发展历史酶组织化学发展历史l 19391939年以前年以前：主要研究细

2、胞内的：主要研究细胞内的氧化还氧化还原反应原反应，未出现酶组织化学方法，未出现酶组织化学方法 （如（如KlebsKlebs和和Stuve Stuve 指出指出愈创木酯酊愈创木酯酊同同脓作用能产生蓝色脓作用能产生蓝色过氧化物酶）过氧化物酶）19391939年：酶组织化学真正开始年：酶组织化学真正开始 高松英雄和高松英雄和GomoriGomori碱性磷酸酶碱性磷酸酶（硫（硫化钴反应、银反应）化钴反应、银反应）同年，同年，酸性磷酸酶酸性磷酸酶组织化学方法也发表组织化学方法也发表酶组织化学发展历史酶组织化学发展历史l1940-19501940-1950年年：酶组织化学发展的黄金时期：酶组织化学发展的黄

3、金时期 创立了金属盐法、偶联偶氮色素法创立了金属盐法、偶联偶氮色素法l5050年代后年代后：电镜酶组织化学：电镜酶组织化学 将超薄切片法和电镜技术应用到酶组织化将超薄切片法和电镜技术应用到酶组织化学上，获得了酶的更精确的定位学上，获得了酶的更精确的定位l6060年代后期年代后期：免疫组织化学：免疫组织化学 利用抗原抗体特异性反应来定位酶蛋白利用抗原抗体特异性反应来定位酶蛋白 电镜免疫组化电镜免疫组化酶的种类酶的种类 1.1.氧化还原酶氧化还原酶 2.2.转移酶转移酶 3.3.水解酶水解酶 4.4.裂合酶（裂解酶）裂合酶（裂解酶）5.5.异构酶异构酶 6.6.合成酶（连接酶）合成酶（连接酶）目前

4、，能用酶组织化学方法显示出来，目前，能用酶组织化学方法显示出来，并可进行定性、定位和定量的酶较少，仅并可进行定性、定位和定量的酶较少，仅200200余种，余种，因此潜力巨大。因此潜力巨大。（一）酶的特性（一）酶的特性l 水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂l 有机溶剂不同程度降低酶的活性有机溶剂不同程度降低酶的活性l 易受温度影响，对热耐受性弱易受温度影响，对热耐受性弱l 对干燥耐受性强对干燥耐受性强酶组织化学反应的基本知识酶组织化学反应的基本知识（二）酶的定位（二）酶的定位 酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位 如：如：

5、5-5-核苷酸酶核苷酸酶浆膜浆膜 ATPaseATPase肌球蛋白肌球蛋白 细胞膜细胞膜 线粒体线粒体（三）酶组化的基本条件（三）酶组化的基本条件 同时保存结构和酶的活性同时保存结构和酶的活性 保存酶的定位，防止酶的扩散或移位保存酶的定位，防止酶的扩散或移位 保证反应产物的特异性保证反应产物的特异性*影响酶活性的因素：影响酶活性的因素：温度温度 PHPH值值 抑制剂抑制剂 激活剂激活剂基本原理基本原理 细胞内的酶催化分解合适的底物，细胞内的酶催化分解合适的底物，生成生成中间产物中间产物（即初级反应产物），然后（即初级反应产物），然后其中之一再与其中之一再与辅助物辅助物（或捕捉剂）反应，（或捕捉

6、剂）反应，生成生成有色不溶性有色不溶性的的终反应产物终反应产物，该反应产，该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在物沉积在原位，以显示酶的存在（四）原理及一般原则（四）原理及一般原则 第一反应：第一反应：酶促反应酶促反应 底物底物 初级反应产物（初级反应产物（PRPPRP）不可见不可见 第二反应：第二反应：捕捉反应捕捉反应 PRP+PRP+捕捉剂捕捉剂 终反应产物（终反应产物（FRPFRP）酶酶*PRP PRP弥散：弥散：1.1.底物在酶催化下反应的速度底物在酶催化下反应的速度 2.PRP2.PRP在缓冲液中的弥散系数在缓冲液中的弥散系数 3.PRP3.PRP与辅助物反应的速度与辅助物反应的速度

7、应选择合适的底物和辅助物应选择合适的底物和辅助物,减少弥散减少弥散一般原则一般原则l 对组织处理对组织处理,制片过程制片过程不能影响不能影响酶活性及酶活性及分布分布l 所选底物和辅助物必须所选底物和辅助物必须迅速、同步迅速、同步穿透入穿透入组织和细胞中组织和细胞中l 所选所选底物底物最好只能被最好只能被一种酶催化分解一种酶催化分解 l (一个底物可能同时发生几种酶反应，一个底物可能同时发生几种酶反应，为获得特异酶反应，必须使用酶抑制剂或为获得特异酶反应，必须使用酶抑制剂或酶激活剂进行鉴别。酶激活剂进行鉴别。)一般原则一般原则4.4.所选所选辅助物辅助物不影响细胞内酶的活性不影响细胞内酶的活性,

8、不不影响其他反应试剂的穿透性影响其他反应试剂的穿透性5.PRP5.PRP必须迅速与辅助物反应必须迅速与辅助物反应,FRPFRP为水不溶为水不溶性的有色稳定产物性的有色稳定产物6.6.所有参与反应的试剂均所有参与反应的试剂均不能与其他成分不能与其他成分吸附吸附或结合或结合(五五)酶组织化学的主要步骤酶组织化学的主要步骤1 1、固定或不固定的标本、固定或不固定的标本2 2、切片、切片(冷冻或不冷冻冷冻或不冷冻)3 3、孵育、孵育4 4、显色、显色5 5、显微镜下观察、显微镜下观察（六）各步骤注意问题（六）各步骤注意问题l 检测方法的选择检测方法的选择l 酶的保存与固定酶的保存与固定 一般新鲜组织快

9、速冷冻一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片冰冻切片(-70(-70长期长期保存；可用丙酮保存；可用丙酮氯仿氯仿=11=1144，5 51010分分钟稍固定钟稍固定)固定剂固定剂:抑制酶活性和细胞化学成分活性的重抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金属盐金属盐HgHg、CrCr、PbPb等不能用做固定剂；慎用醛等不能用做固定剂；慎用醛类类固定方法固定方法:浸泡固定浸泡固定 灌流固定灌流固定固定温度固定温度:04:043.3.切片制作切片制作:切片厚度切片厚度40um40um，一般，一般8 812um12um4.4.缓冲液选择缓冲液选择 缓冲液用于缓冲液用于 A.A.配置固定液配置固定液 B.B.漂洗液漂洗

10、液 C.C.配置酶反应孵育液配置酶反应孵育液 选择缓冲液应注意选择缓冲液应注意 A.A.不能减弱目标酶的活性不能减弱目标酶的活性 B.B.不能含有与捕捉机制相同不能含有与捕捉机制相同的物质的物质 C.C.注意漂洗用缓冲液的渗透压注意漂洗用缓冲液的渗透压 D.D.漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同5.5.孵育反应孵育反应 A.A.孵育液配置孵育液配置:底物浓度量要足够底物浓度量要足够120(V/V);120(V/V);孵育液只能用一次，配制时要适量孵育液只能用一次，配制时要适量配制孵育液的要求配制孵育液的要求 清洗器具，过酸冲清洗器具，过酸冲洗洗

11、。现用现配，保持新现用现配，保持新鲜鲜。严格配比，保持严格配比，保持平平衡。衡。防止污染，过防止污染，过滤滤为佳。为佳。优选试剂，注意优选试剂，注意纯纯度。度。5.5.孵育反应孵育反应 B.B.孵育的温度和时间孵育的温度和时间:37 15-30min37 15-30min C.C.切片孵育法切片孵育法 -切片孵育切片孵育 -漂浮孵育漂浮孵育6.6.酶特异性对照实验酶特异性对照实验 用酶活性用酶活性抑制剂抑制剂 采用采用无底物无底物的孵育液的孵育液 过固定或加热过固定或加热 用针对目标酶的用针对目标酶的激活剂激活剂 改变孵育液改变孵育液底物底物 选择选择PHPH 酶细胞内的酶细胞内的定位差异定位

12、差异对结果的分析应考虑的问题对结果的分析应考虑的问题 1 1、经过冻结和固定后，酶究竟能保存多少？、经过冻结和固定后，酶究竟能保存多少？2 2、酶是否在原位？、酶是否在原位？3 3、反应中酶起了多少作用？、反应中酶起了多少作用？4 4、酶的活性是否代表了细胞生活时的状态？、酶的活性是否代表了细胞生活时的状态？5 5、沉淀的产物是否能代表酶本身，时间延长，、沉淀的产物是否能代表酶本身，时间延长，会不会改变？有没有扩散移位？会不会改变？有没有扩散移位？显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法一、金属离子沉淀法一、金属离子沉淀法 （金属金属盐法）（金属金属盐法）金、银、铜、铁、铝、钴金、银、铜、铁、

13、铝、钴等金属等金属 利用某些金属本身具有颜色或其化合物具利用某些金属本身具有颜色或其化合物具有颜色（硫化钴，黑色；硫化铅，棕黑色等）有颜色（硫化钴，黑色；硫化铅，棕黑色等）原理：原理：以酶作用于底物时，分解产物与底物混以酶作用于底物时，分解产物与底物混合液中的某种物质结合，沉着在作用的局部，合液中的某种物质结合，沉着在作用的局部，接着用金属置换结合物质，通过金属显色来证接着用金属置换结合物质，通过金属显色来证明酶的反应。明酶的反应。优点：优点：反应迅速，沉着颗粒微细，色调美丽，反应迅速，沉着颗粒微细，色调美丽，且由于金属离子的高电子密度而可用于电镜且由于金属离子的高电子密度而可用于电镜组织化学

14、研究。组织化学研究。缺点：缺点：金属盐的移动、扩散和吸附现象金属盐的移动、扩散和吸附现象 一般用于显示一般用于显示磷酸酶。磷酸酶。如：如：AKPAKP，ACPACP，G-6-PaseG-6-Pase、ATPaseATPase、TPPaseTPPase、ACaseACase 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKP）碱性条件下（碱性条件下（pH9.0-9.6pH9.0-9.6）催化各种醇和酚）催化各种醇和酚的磷酸酯水解的磷酸酯水解 激活剂：激活剂：Mg2+Mg2+、Mn2+Mn2+、Zn2+Zn2+、Co2+Co2+抑制剂：抑制剂：半胱氨酸、氰化物、砷酸盐半胱氨酸、氰化物、砷酸盐 定位：定位：转运功能活跃

15、的转运功能活跃的细胞膜细胞膜，广泛存在，广泛存在于肾小管、小肠绒毛、膀胱、肾上腺、肝、于肾小管、小肠绒毛、膀胱、肾上腺、肝、脾、乳腺及卵巢。脾、乳腺及卵巢。碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKP）钙钴法钙钴法原理原理以天然存在的以天然存在的甘油磷酸钠甘油磷酸钠为为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为磷酸钙，再依次被置换为磷离子沉淀为磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化硫化钴钴沉淀。沉淀。碱性磷酸酶（硫化钴法或钙钴法）碱性磷酸酶（硫化钴法或钙钴法）若将磷酸钙浸渍于若将磷酸钙浸渍于硝酸银硝酸银溶液，则置换成磷溶液

16、，则置换成磷酸银然后用其还原剂使其产生银反应，称为酸银然后用其还原剂使其产生银反应，称为硝酸硝酸银法或银反应法银法或银反应法 1 1、上述方法有两个阶段：酶作用产物沉着上述方法有两个阶段：酶作用产物沉着阶段，金属置换的第二阶段，称为阶段，金属置换的第二阶段，称为二步显二步显示法（孵育后偶联法）示法（孵育后偶联法）优点：优点：是可以充分满足这两种反应的是可以充分满足这两种反应的最适最适PHPH；有时酶促底物的水解反应要求较长的；有时酶促底物的水解反应要求较长的孵育时间孵育时间，而有些各自要求的辅助物在这，而有些各自要求的辅助物在这段时间中已开始分解，用二步显示法可避段时间中已开始分解，用二步显示

17、法可避免此不足。免此不足。局限性：局限性：是要求是要求PRPPRP停留原位不发生弥散。停留原位不发生弥散。方法方法标本：标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片，厚大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片，厚8 8微米。微米。固定：固定：丙酮丙酮氯仿（氯仿（1111）混合液。）混合液。4 24 255切片标本入下列孵育液中，切片标本入下列孵育液中，3737，时间摸索，时间摸索 孵育液：孵育液：3 3甘油磷酸钠甘油磷酸钠 底物底物 2 2巴比妥钠巴比妥钠 调调PHPH 2 2氯化钙（无水，或硝酸钙）沉淀剂氯化钙（无水，或硝酸钙）沉淀剂 2 2硫酸镁硫酸镁 激活剂激活剂 蒸馏水蒸馏水 将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调将孵

18、育液混匀，若浑浊可过滤，调PHPH至至9.49.4 流水流水洗流水流水洗2 2分钟后分钟后入蒸馏水入蒸馏水 入入2 2硝酸钴，硝酸钴，5 5分钟（小肠可分钟（小肠可3 3分钟）分钟）流水洗流水洗5 5分钟，入蒸馏水。分钟，入蒸馏水。入入0.50.5硫化胺，硫化胺，2 2分钟。分钟。流水洗流水洗1010分钟，入蒸馏水。分钟，入蒸馏水。入入MayerMayer氏苏木精染液氏苏木精染液(复染核复染核)1)1分钟分钟 流水洗流水洗5 5分钟分钟蒸馏水。蒸馏水。甘油明胶或甘油明胶或ApathyApathy糖胶封固糖胶封固 结果：结果：肾小体（近端小管）刷状缘、小肠肾小体（近端小管）刷状缘、小肠绒毛纹状缘

19、和血管内皮出现绒毛纹状缘和血管内皮出现棕黑色或黑棕黑色或黑色色的硫化钴沉淀，显示的硫化钴沉淀，显示AKPAKP活性强活性强 。评价：评价：此法反应产物可发生扩散，此法反应产物可发生扩散，定位欠定位欠准确准确；肾曲管碱性磷酸酶肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法钙钴法 X100肾曲管碱性磷酸酶肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法钙钴法 X200 大鼠小肠绒毛吸收细胞呈深棕色 对照对照 无底物孵育无底物孵育，以蒸馏水代替孵育液中，以蒸馏水代替孵育液中的的3 3甘油磷酸钠，其余各步进行同上。甘油磷酸钠，其余各步进行同上。加热加热灭活酶活性。灭活酶活性。加抑制剂加抑制剂，左旋咪唑，左旋咪唑0.10.11.0mmol/L1.0

20、mmol/L注意事项注意事项CaCa2+2+要足量要足量 用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性 有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色 素）出现，可影响结果。素）出现，可影响结果。也可用石蜡切片，（石蜡切片可显示大多数水也可用石蜡切片，（石蜡切片可显示大多数水解酶）解酶）本法可用显示：本法可用显示：55核苷酸酶、肌蛋白核苷酸酶、肌蛋白ATPaseATPase、AKPAKP金属离子沉淀法金属离子沉淀法2 2、同步法、同步法 细胞中的酶催化底物水解生成的分解细胞中的酶催化底物水解生成的分解产物产物立即与立即与金属离子反应金属离子反应成为

21、有色不成为有色不溶的沉积在原位以显示酶的存在。溶的沉积在原位以显示酶的存在。如：如：酸性磷酸酶酸性磷酸酶铅法铅法铅法铅法显示酸性磷酸酶显示酸性磷酸酶(ACP)原理原理 以以甘油磷酸钠甘油磷酸钠为底物，在为底物，在酸性酸性PHPH下，被下，被ACPACP水解，释放出磷酸盐，遇铅离子水解，释放出磷酸盐，遇铅离子则生成则生成磷酸铅磷酸铅沉淀。在被沉淀。在被S S2-2-置换，最终生置换，最终生成成硫化铅硫化铅棕色沉淀。棕色沉淀。酸性磷酸酶酸性磷酸酶硝酸铅法硝酸铅法 要求：要求：在底物溶液中的在底物溶液中的H H浓度为弱酸性的条件浓度为弱酸性的条件 常用常用硝酸铅硝酸铅或或醋酸铅醋酸铅 应用：应用：酸

22、性磷酸酶和在中性附近其作用的磷酸酯酸性磷酸酶和在中性附近其作用的磷酸酯酶类。最早把本法应用于酸性磷酸酶的是酶类。最早把本法应用于酸性磷酸酶的是GomoriGomori（19411941），也称为），也称为硫化铅法硫化铅法 该方法金属离子容易反应，沉着颗粒微细，反应该方法金属离子容易反应，沉着颗粒微细，反应色调美丽，反差比较鲜明。色调美丽，反差比较鲜明。ACP ACP的特性的特性 PH 4.5 PH 4.55.55.5适宜适宜 激活剂：激活剂：MnMn2+2+抑制剂：抑制剂：NaFNaF，有些，有些ACPACP为为CuCu2+2+、酒石酒石 酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂

23、。ACPACP定位定位 溶酶体（颗粒状）内；溶酶体（颗粒状）内；溶酶体外溶酶体外ACPACP存在于存在于ERER和胞液。和胞液。该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、肾上腺。肾上腺。方法：方法：标本：标本：大白鼠肾、肝恒冷箱切片，大白鼠肾、肝恒冷箱切片，6-86-8微米微米固定：固定：本实验不固定或固定于丙酮本实验不固定或固定于丙酮氯仿（氯仿（1111）2 25min5min或或1010福尔马林钙福尔马林钙10min10min步骤：步骤：入入孵育液孵育液中中 3737 孵育液：孵育液：0.1M0.1M醋酸缓冲液，醋酸缓冲液，PH4.75.0 PH4.75.0 0.

24、24 0.24硝酸铅硝酸铅 3 3甘油磷酸钠甘油磷酸钠 要求完全透明后，过滤备用（可用要求完全透明后，过滤备用（可用TrisTris顺丁顺丁烯二酸缓冲液或乙酸巴比妥缓冲液）烯二酸缓冲液或乙酸巴比妥缓冲液）于于3737蒸馏水中洗蒸馏水中洗2 2次，每次次，每次1 1分钟。分钟。（温蒸馏水洗）（温蒸馏水洗）入入5 5硫化胺硫化胺，1 12 2分钟。分钟。流水冲洗流水冲洗3 35 5分钟后，换蒸馏水。分钟后，换蒸馏水。（可用苏木精复染核）（可用苏木精复染核）用甘油明胶或用甘油明胶或ApathyApathy氏糖胶封固。氏糖胶封固。结果结果 酶活性部位酶活性部位棕黑色棕黑色硫化铅沉淀。硫化铅沉淀。分布于

25、肾近曲小管细胞核周围，肝细分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒 对照：对照：1 1、孵育液内加、孵育液内加0.01M 0.01M NaFNaF 2 2、去底物实验、去底物实验 肾小管上皮细胞肾小管上皮细胞注意事项注意事项 铅离子的浓度铅离子的浓度是关键问题，没有底物，是关键问题，没有底物，有些组织吸附铅离子（有些组织吸附铅离子（+），因此必须用），因此必须用NaFNaF抑制酶活性抑制酶活性排除假阳性反应。排除假阳性反应。孵育时间不可过长，否则染色扩散或核孵育时间不可过长，否则染色扩散或核染色。染色。应用范围应用范围 “铅法铅法”适用于：适用于

26、：ACPACP，5-5-核苷酸酶、核苷酸酶、G6PG6P酶酶;膜膜ATPaseATPase、MitoATPaseMitoATPase、TTPaseTTPase（硫胺素（硫胺素焦磷酸酶）焦磷酸酶）显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法二、偶联偶氮色素法二、偶联偶氮色素法（偶氮色素法）（偶氮色素法）指用人工合成的酶底物，在酶的作指用人工合成的酶底物，在酶的作用下，产生分解产物，后者与用下，产生分解产物，后者与重氮盐重氮盐结结合，引起合，引起偶联偶氮反应偶联偶氮反应，使其形成，使其形成不溶不溶性的偶氮色素性的偶氮色素，以此证明酶的定位。，以此证明酶的定位。（二）偶氮偶联法（偶氮色素法）（二）偶氮偶

27、联法（偶氮色素法）1.原理原理底物混合液底物混合液 PRP与与 不溶性不溶性 重氮盐结合重氮盐结合 偶氮色素偶氮色素2.方法方法 同时偶联法同时偶联法 后偶联法后偶联法酶酶 偶氮偶联偶氮偶联显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法 重氮盐种类不同，其重氮盐种类不同，其偶氮颜色多样偶氮颜色多样（蓝（蓝色、紫色、红色、褐色、黑色、棕色等）色、紫色、红色、褐色、黑色、棕色等）重氮盐还有不同程度的重氮盐还有不同程度的抑制酶活性作用抑制酶活性作用，故必须选用其中抑制作用最弱的种类使故必须选用其中抑制作用最弱的种类使用。用。常用底物常用底物 萘酚萘酚AS-BI AS-BI 萘酚萘酚AS-DAS-D 萘酚萘

28、酚AS-MX AS-MX 萘酚萘酚AS-TRAS-TR常用重氮盐常用重氮盐 坚牢兰坚牢兰RR RR 坚牢兰坚牢兰B B 坚牢红坚牢红RCRC 坚牢红坚牢红TR TR 坚牢紫坚牢紫B B 六偶氮副品红六偶氮副品红 六偶氮新品六偶氮新品红红应用：应用：可显示可显示ALPase,ACPase,ALPase,ACPase,酯酶酯酶,转转肽酶肽酶,肽酶肽酶,-,-葡糖苷酶等葡糖苷酶等偶氮色素法分类偶氮色素法分类（一）同时偶联法（一）同时偶联法 在底物混合液中，通过酶的分解作用所得在底物混合液中，通过酶的分解作用所得到的沉积物，立即形成重氮化合物和偶氮到的沉积物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。色素。（二）

29、后偶联法（二）后偶联法 为了为了防止重氮盐对酶的抑制作用防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶，先使酶在底物内发生作用，使分解产物沉着，然在底物内发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮后再浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素。色素。偶氮偶联法显示偶氮偶联法显示ACPACP原理原理 以以奈酚的衍生物磷酸酯奈酚的衍生物磷酸酯为底物，在为底物，在酸性酸性PHPH（5.25.2）下，经酸性磷酸酶水解）下，经酸性磷酸酶水解释放出释放出萘酚萘酚ASBIASBI，立即与，立即与六氮化对品六氮化对品红红偶联，生成偶联，生成红色红色偶氮染料，用以代表偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。酸性磷酸

30、酶活性。方法方法标本：标本：大白鼠肾、肝恒冷箱切片，厚大白鼠肾、肝恒冷箱切片，厚8-108-10微米。微米。不固定或固定于丙酮不固定或固定于丙酮氯仿（氯仿（1111）混合液）混合液内，内，44，2 25min5min 标本入下列孵育液标本入下列孵育液，3737，30306060分钟。分钟。孵育液：磷酸奈酚孵育液：磷酸奈酚ASBI ASBI 二甲基亚砜二甲基亚砜 （溶剂）（溶剂）六氮化对品红六氮化对品红 缓冲液缓冲液 充分混匀并充分混匀并过滤过滤 蒸馏水洗蒸馏水洗 入入MayerMayer苏木精内染苏木精内染1 1分钟。分钟。流水冲流水冲5 5分钟后入蒸馏水。分钟后入蒸馏水。用用ApathyAp

31、athy糖胶或甘油明胶封固。糖胶或甘油明胶封固。结果结果 酶的活性部位呈酶的活性部位呈红色红色，核兰色。，核兰色。分布于肾近端小管核周，肝毛细胆管周围。分布于肾近端小管核周，肝毛细胆管周围。涂片涂片-腹腔巨噬细胞腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶酸性磷酸酶 X400对照对照用抑制剂NaF浓度为10mmol/L注意事项注意事项 六氮盐浓度不能太高 背景会略带黄色显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法三、三、色素形成法色素形成法 在酶作用下使无色化学物质在局部形成色在酶作用下使无色化学物质在局部形成色素沉着素沉着1 1、四唑盐法、四唑盐法2 2、联苯胺色素法、联苯胺色素法3 3、靛酚蓝法（吲哚酚法）、靛酚蓝

32、法（吲哚酚法）显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法（一）四唑盐法（一）四唑盐法 含有四唑盐或双四唑盐的底物混合含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液，在液，在脱氢酶脱氢酶的作用下，从底物分离出的作用下，从底物分离出来的来的氢原子氢原子与与无色的四唑盐无色的四唑盐或双四唑盐或双四唑盐相结合，形成相结合，形成红色或蓝色红色或蓝色的甲臢或二甲的甲臢或二甲臢色素。臢色素。四唑盐法四唑盐法 用于显示氧化酶和脱氢酶用于显示氧化酶和脱氢酶 原理原理:四唑盐或双四唑盐四唑盐或双四唑盐 氢离子氢离子 与与 与与 底物混合液底物混合液 无色四唑盐结合无色四唑盐结合 红色或兰色的沉淀红色或兰色的沉淀 脱氢酶脱氢酶 +

33、2H被还原被还原 常用四唑盐种类常用四唑盐种类 三苯四唑氯化物三苯四唑氯化物 TTC 蓝四唑盐蓝四唑盐 BT 新四唑盐新四唑盐 NT 硝基蓝四唑硝基蓝四唑 NBT 四硝基蓝四唑四硝基蓝四唑 TNBT 噻唑蓝噻唑蓝 MTT 以以琥珀酸（钠盐）琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑硝基蓝四唑（NBTNBT）为受为受H H体，其接受体，其接受H H后被还原成紫色不溶物后被还原成紫色不溶物以代表琥珀酸脱氢酶的活性。以代表琥珀酸脱氢酶的活性。四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶 琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。琥珀酸脱氢酶是线粒体的

34、标志酶之一。SDHSDH存在于所有有氧呼吸的细胞，以心存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富 抑制物：抑制物：丙二酸盐（竞争抑制）丙二酸盐（竞争抑制）对照对照【孵育液】【孵育液】0.1M 0.1M 琥珀酸钠琥珀酸钠,0.1M,0.1M 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 NBT(NBT(硝基蓝四唑硝基蓝四唑)【步骤】【步骤】1.1.新鲜组织低温冰冻切片新鲜组织低温冰冻切片 2.2.孵育液孵育液15-35 15-35 分钟分钟 3.3.生理盐水洗生理盐水洗 4.Fca(4.Fca(氯化钙氯化钙Formalin)Formalin)固定固定101

35、0分钟分钟 5.5.入入80%80%乙醇乙醇5 5分钟分钟 6.6.甘油明胶封固甘油明胶封固【结果】【结果】酶活性处为蓝紫色沉淀酶活性处为蓝紫色沉淀小鼠心肌冰冻切片小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 X400 思考题：思考题：在细胞培养中，常用的在细胞培养中，常用的MTTMTT法法测定细胞活测定细胞活性，用的是什么原理？检测的是什么酶？性，用的是什么原理？检测的是什么酶？显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法（二）联苯胺色素法（二）联苯胺色素法 检测检测过氧化物酶过氧化物酶 酶作用释放的酶作用释放的氧氧使无色的联苯胺使无色的联苯胺脱氢脱氢而而形成有色的形成有色的联苯胺蓝联苯胺蓝，再形

36、成联苯胺褐。，再形成联苯胺褐。【结果】【结果】酶活性处呈棕色酶活性处呈棕色过氧化物酶过氧化物酶o 催化各种物质被过氧化氢（催化各种物质被过氧化氢（H H2 2O O2 2）所氧化）所氧化o 见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等o 髓过氧化物酶髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体见于中性和嗜酸性白细胞及其前体细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要o 免疫组化中常用免疫组化中常用辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）作为大）作为大分子示踪剂分子示踪剂【显示方法】【显示方法】二氨基联苯胺法二氨基联苯胺法示过氧化

37、物酶示过氧化物酶【基本原理】【基本原理】过氧化物酶作用于底物（过氧化物酶作用于底物（3 3，3-3-二氨基联苯胺，二氨基联苯胺，DABDAB），催化底物被），催化底物被H H2 2O O2 2氧化，生成棕色的沉淀氧化，生成棕色的沉淀【作用液】【作用液】DABDAB，Tris-HclTris-Hcl缓冲液，缓冲液，H H2 2O O2 2【结果】酶活性处呈棕色【结果】酶活性处呈棕色小鼠腹腔巨噬细胞小鼠腹腔巨噬细胞-过氧化物酶过氧化物酶 *400白血病涂片白血病涂片-过氧化物酶过氧化物酶 X400显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法（三）靛酚蓝法（吲哚酚法）（三）靛酚蓝法（吲哚酚法）用于检测用

38、于检测氧化酶氧化酶，也可用于细胞色素氧，也可用于细胞色素氧化酶和过氧化物酶等。化酶和过氧化物酶等。把把二甲基对苯二胺二甲基对苯二胺和和萘酚萘酚加入加入底物混合液中，由酶作用而释放的底物混合液中，由酶作用而释放的氧氧与与此二者发生结合，形成此二者发生结合，形成靛酚蓝靛酚蓝，而显示，而显示出酶的定位。出酶的定位。如细胞色素氧化酶如细胞色素氧化酶显示酶的组织化学的其他方法显示酶的组织化学的其他方法 色素底物法色素底物法是将有的色素盐类作为酶是将有的色素盐类作为酶的底物，它本身不染组织细胞，但在酶的的底物，它本身不染组织细胞，但在酶的作用下分解出来的色素却能沉着于酶所在作用下分解出来的色素却能沉着于酶

39、所在部位。部位。底物标记法底物标记法是指用同位素、色素、金是指用同位素、色素、金属标记酶的底物，在酶的作用下，底物分属标记酶的底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在部位，通过各种方法对解后沉着于酶所在部位，通过各种方法对此进行检测。此进行检测。酶组织化学的应用酶组织化学的应用l 了解组织、细胞的代谢活动了解组织、细胞的代谢活动l 细胞类型的判断细胞类型的判断l 了解细胞定位了解细胞定位l 用于肿瘤的研究用于肿瘤的研究l 用于免疫组化和杂交组化的显示手段用于免疫组化和杂交组化的显示手段要求掌握的酶要求掌握的酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 酸性磷酸酶酸性磷酸酶 葡萄糖葡萄糖6 6磷酸酶磷酸酶 三磷酸腺苷酶三磷酸腺苷酶 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 过氧化物酶法过氧化物酶法