课题3分解纤维素的微生物的分离课件.ppt

1、 酵母膏中含有碳元素，可以作为微生物生长的碳源，同时又富含微生物生长所需要的必需氨基酸以及维生素、核苷酸、微量元素等，可以有效的为微生物生长提供氮源和生长因子。然而在本实验中酵母膏加入的量很少，如果作为碳源或氮源的话不足以维持纤维素分解菌的生长，所以可以说纤维素作为分解菌的主要能量来源，是唯一碳源。分离纤维素分解菌的选择培养基中应以纤维素作唯一碳源,为什么要加酵母膏?一、基础知识1 1、纤维素的化学组成及在生物圈的分布状况？、纤维素的化学组成及在生物圈的分布状况？植物植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中其中,是自然界中纤维素含量最高的天然产是自然

2、界中纤维素含量最高的天然产物。物。棉花棉花2 2、纤维素酶的组成及作用？、纤维素酶的组成及作用？纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般认为它至少包括三，一般认为它至少包括三种组分，即种组分，即 和和 ，前，前两种酶使纤维素分解成两种酶使纤维素分解成纤维二糖纤维二糖，第三种酶将纤，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。维二糖分解成葡萄糖。葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶C C1 1酶、酶、CxCx酶酶纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素取二支取二支20mL20mL的试管的试管3、实验：纤维素酶分解纤维素的实验、实验：纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张

3、滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为 0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓的醋酸醋酸钠缓冲液冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放两支试管固定在锥形瓶中，放在在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？失？甲试管的作用是什么？（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法是

4、、筛选纤维素分解菌的方法是_。该方法可以通过该方法可以通过_反应直接反应直接对微生物对微生物进行进行筛选。筛选。刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色阅读课本课本阅读课本课本28页相关部分，回答下列问题：页相关部分，回答下列问题：2、筛选、筛选 原理是：刚果红可以与纤维素形成原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被，当纤维素被_分解分解后，红色复合物无法形成，出现以后，红色复合物无法形成，出现以_为中心的为中心的_，我们可，我们可以通过以通过_ 来筛选纤维素分来筛选纤维素分解菌。解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈土壤取样土

5、壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上素分解菌的培养基上挑选产生透明挑选产生透明圈的菌落圈的菌落（操作流程）（操作流程）（此步可省略）二、实验设计二、实验设计【土壤取样土壤取样】采集土样时，应选择富含纤维素采集土样时，应选择富含纤维素的环境。的环境。将滤纸埋于深约将滤纸埋于深约10cm10cm的腐殖土壤中。的腐殖土壤中。3030天后从腐烂的滤纸上筛选纤维素分天后从腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。解菌。1、为什么要在富含纤维素的环境中找纤维、为什么要在富含纤维素的环境中找纤维素分解菌？素分解菌？2、将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤、将滤

6、纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深纸应该埋进土壤多深？人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境，使人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。的腐殖土壤中。在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对较高对较高1、实验流程中、实验流程中“选择培养选择培养”的目的是的目的是什么？什么？其目的是增加纤维素分解菌的浓度，其目的是增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。微生物。【选择培养选择培养】阅读资料二阅读资料二

7、“选择培养基选择培养基”回答问题回答问题培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要的营养提供主要的营养物质物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、碳源、氮生长因子、碳源、氮源源水解酪素水解酪素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定溶解后，蒸馏水定容至容至1000mL水水分析旁栏中的培养基配方，回分析旁栏中的培养基配方，回答以下几问题：答以下几问题：2、制备选择培养基、制

8、备选择培养基1）纤维素分解菌选择培养基属）纤维素分解菌选择培养基属于于_（固体、液体）培养（固体、液体）培养基，原因是基，原因是_液体液体没有添加琼脂没有添加琼脂2）该培养基对微生物）该培养基对微生物_（具有，不具有）选（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机择作用。如果具有，其选择机制是制是_ _。具有具有 以纤维素粉为主要碳源，能分解以纤维素粉为主要碳源，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖纤维素的微生物可以大量繁殖 若设置一个对照实验说明选择培养的作用，若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将应控制的变量是将_改为改为_。或用或用 培养基与之对照培养基与之对照.3 3）你能

9、否设计一个对照实验，说明选择培养）你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？基的作用？葡萄糖葡萄糖纤维素粉纤维素粉牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨3、具体操作：、具体操作：将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在将锥形瓶固定在摇床上摇床上，在一定温度下震荡，在一定温度下震荡培养培养12天，直至培养液天，直至培养液变浑浊变浑浊。也可重复。也可重复选择培养选择培养 在选择培养的条件下，可以使那些在选择培养的条件下，可以使那些能够能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖

10、不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制被抑制，因此可以起到，因此可以起到“浓缩浓缩”的作用的作用旁栏思考旁栏思考4为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？101102103104105106【】培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na(水溶性羧甲基纤水溶性羧甲基纤维素钠维素钠)510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000

11、mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落【资料三资料三】刚果红染色法刚果红染色法方法一：方法一：先培养微生物，再加先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应入刚果红进行颜色反应方法二：方法二：在倒平板时就加入刚果红在倒平板时就加入刚果红两种常用刚果红染色法的比较项项目目先培养微生物再加入刚果红先培养微生物再加入刚果红在倒平板时加入刚果红在倒平板时加入刚果红过过程程优优点点缺缺点点配制配制CRCR溶液（质量浓度溶液（质量浓度为为10mg/mL10mg/mL）灭菌灭菌按按照照1mL CR1mL CR溶液溶液/200mL/2

12、00mL培培养基的比例混匀养基的比例混匀倒平倒平板板培养培养产生透明圈产生透明圈培养长出菌落培养长出菌落覆盖覆盖CRCR溶液溶液（质量浓度为（质量浓度为1mg/mL1mg/mL）倒出倒出CRCR溶液溶液加入加入NaclNacl溶液溶液(物物质的量浓度为质的量浓度为1mg/L)1mg/L)倒倒掉掉NaclNacl溶液溶液产生透明圈产生透明圈10-15min15min方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。三、操作提示三、操作提示（一）复习微生物技术（一）复习微

13、生物技术（二）选择培养的操作方法（二）选择培养的操作方法 选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。生物与环境的互相依存关系，在富含纤维生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境普通环境1、取样的环境是怎样的，作出这种选择的理取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？由是什么？四、结果分析与评价四、结果分析与评价 2.2.

14、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否合格培养基的制作是否合格以及选择培养基是否合格 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。说明可能获得了分解纤维素的微生物。3.3.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌土

15、样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。等不同的分离结果。五、课题延伸五、课题延伸 本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行的是纤维素分解菌，还需要进行 的实验，纤维素酶的发酵方法有的实验，纤维素酶的发酵方法有 发酵和发酵和 发酵。发酵。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的纸等纤维素后所产生的 进行定量的测定。进行定量的测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶液体液

16、体固体固体葡萄糖葡萄糖分分解解纤纤维维素素的的微微生生物物的的分分离离纤维素酶纤维素酶种类、作用种类、作用刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌 六、课堂总结六、课堂总结操作提示操作提示课题延伸课题延伸结果分析与评价结果分析与评价复习微生物技术选择培养的操作方法环境特点，取样理由环境特点，取样理由培养基是否合格，是否筛选出菌落培养基是否合格，是否筛选出菌落分离结果是否一致分离结果是否

17、一致发酵产纤维素酶实验鉴定发酵产纤维素酶实验鉴定练一练：练一练：1.1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是下列关于纤维素酶的说法，错误的是A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖D2.2.利用刚果红染色法可以筛选出纤维素分解利用刚果红染色法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是菌，下列说法错误的是A.A.刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物 B.

18、B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C.C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了纤维素分解菌B练一练：练一练：3、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（解菌，符合下列哪一生物学观点？（）A、生物结构与功能相适应的观点、生物结构与功能相适应的观点 B、生物结构与功能整体性观点、生物结构与功能整体性观点C、生物与环境相适应的观点、生物与环境相适应的观点 D、生物发展进化的观点、生

19、物发展进化的观点C练一练：练一练：练一练练一练4、从土壤中分离获得某种微生物的步骤、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（是（）土壤取样土壤取样 梯度稀释梯度稀释 选择培养选择培养 菌悬液涂布平板菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落挑选出单个菌落A、B、C、D、B练一练练一练5、有关选择培养正确的叙述是（、有关选择培养正确的叙述是（）A、可以增加纤维素分解菌的浓度、可以增加纤维素分解菌的浓度B、可以减少纤维素分解菌的浓度、可以减少纤维素分解菌的浓度C、所用培养基是固体培养基、所用培养基是固体培养基D、所用培养基是平板培养基、所用培养基是平板培养基A比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解

20、菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素为唯一氮源的尿素为唯一氮源的选择培养基上选择培养基上将细菌培养在以将细菌培养在以纤维素粉做主要碳源纤维素粉做主要碳源的选择培养基上的选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养，增加浓度选择培养，增加浓度比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养培养基类基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中

21、，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入养基中加入酚红酚红指示剂，如指示剂，如果果pHpH升高指示剂会升高指示剂会变红变红刚果红刚果红可以与纤维素形成可以与纤维素形成红色复合物红色复合物，当纤维素被，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的菌为中心的透明圈透明圈观察菌落周围观察菌落周围是否有红色的是否有红色的环带环带出现来鉴定尿素分解菌出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围观察菌落周围是否出现是否出现透明圈透明圈来筛选纤维素分解菌来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法