细胞工程学课件.ppt

1、细胞工程学 20世纪世纪70年代，以胚胎工程为核心的年代，以胚胎工程为核心的生物技术育种体系的应用，正逐步取代以生物技术育种体系的应用，正逐步取代以杂交和选择为主要手段的传统育种方法，杂交和选择为主要手段的传统育种方法，给世界畜牧业及其相关领域的发展注入新给世界畜牧业及其相关领域的发展注入新的活力。胚胎工程是在胚胎移植技术的基的活力。胚胎工程是在胚胎移植技术的基础上发展起来的现代生物技术。础上发展起来的现代生物技术。主要应用主要应用:1在家畜改良方面的应用在家畜改良方面的应用 2在特定品种扩繁上的应用在特定品种扩繁上的应用3在动物生物多样性上的应用在动物生物多样性上的应用4其它方面的应用其它方

2、面的应用第一节第一节 胚胎移植技术胚胎移植技术 胚胎移植也称受精卵移植，是将胚胎移植也称受精卵移植，是将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵良种母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到具同种生理状态的母畜体内，移植到具同种生理状态的母畜体内，使之继续发育成新个体，所以也称为使之继续发育成新个体，所以也称为“借腹怀胎借腹怀胎”。一、胚胎移植的发展历史与意义一、胚胎移植的发展历史与意义 1胚胎移植的发展历史胚胎移植的发展历史1890年，剑桥大学的年，剑桥大学的Walter Heape首次提出首次提出 了受精卵可以在宿主母体内发育的可能。了受

3、精卵可以在宿主母体内发育的可能。20世纪世纪30年代以来，科学家先后在绵羊年代以来，科学家先后在绵羊（1934年）、猪（年）、猪（1951年）、山羊（年）、山羊（1974年）、牛（年）、牛（1978年）和家兔（年）和家兔（1979年）等年）等家畜上进行胚胎移植实验，并相继获得成功。家畜上进行胚胎移植实验，并相继获得成功。2胚胎移植的意义胚胎移植的意义（1）发挥优良母畜的繁殖潜力）发挥优良母畜的繁殖潜力（2）促进家畜改良的速度）促进家畜改良的速度（3）作为胚胎操作的基础）作为胚胎操作的基础（4）保存遗传资源）保存遗传资源二、胚胎移植的操作流程二、胚胎移植的操作流程1同期发情和超数排卵同期发情和超

4、数排卵（1）供体、受体的选择）供体、受体的选择畜牧学选择胚胎移植的供体要求是畜牧学选择胚胎移植的供体要求是加快繁殖的生产能力较高的优良品加快繁殖的生产能力较高的优良品种，受体则是繁殖性能较高的本地种，受体则是繁殖性能较高的本地品种。品种。兽医学选择排除病畜，尤其生殖器兽医学选择排除病畜，尤其生殖器官病患。官病患。生理学选择重点捡出超排和同期发生理学选择重点捡出超排和同期发情处理前的卵巢活性，即卵泡发育情处理前的卵巢活性，即卵泡发育和黄体功能。和黄体功能。（2）同期发情）同期发情 同期发情又称同步发情，就是利用某些同期发情又称同步发情，就是利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周激素制剂人

5、为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。期的进程，使之在预定时间内集中发情。哺乳动物的生殖周期是各式各样的，有哺乳动物的生殖周期是各式各样的，有的一年只有一次发情期，有一定的生殖季节；的一年只有一次发情期，有一定的生殖季节；如如狐、熊狐、熊等一年只出现一次发情周期，它的等一年只出现一次发情周期，它的发情期较长，一年只能生产一次。发情期较长，一年只能生产一次。有的动物有的动物一年出现多次发情周期，则一年出现多次发情周期，则发情期较短，一年生产数次，每次产仔发情期较短，一年生产数次，每次产仔5 56 6个，如个，如鼠类鼠类。有的只有一个繁殖季节，但在繁殖季有的只有一个繁殖季

6、节，但在繁殖季节内可以多次发情；节内可以多次发情；如如水貂、漳水貂、漳等严格受等严格受季节性限制，每年只能产一胎。季节性限制，每年只能产一胎。有的一年任何时期都可以发情，没有有的一年任何时期都可以发情，没有明显的生殖季节。明显的生殖季节。1985年Rall和Fahy用DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇组成玻璃化溶液，进行一步冻存，获得87.如狐、熊等一年只出现一次发情周期，它的发情期较长，一年只能生产一次。剖腹，根据间隔时间确定部位，注入冲卵液回收受精卵。胚胎冷冻保存就是将动物的早期胚胎通过使用特殊的保护剂和降温措施，使其长期保存在超低温环境下。在显微操作仪下固定胚胎，用特制显微刀片将胚胎均匀

7、一分为二，分别装入空透明带中，进行移植。胚胎分割以增加优秀遗传性状的动物数量为主要目的。体外受精效率低的主要原因是人们对卵子发生和胚胎发育的分子机理了解不够。采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体,要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。这些生物技术的综合发展将对人类生活产生重大影响.1986年我国张涌利用胚胎分割获得小鼠后代，1987年获得山羊。兽医学选择排除病畜，尤其生殖器官病患。为克隆技术提供成熟卵母细胞和克隆胚胎的培养体系；1986年我国张涌利用胚胎分割获得小鼠后代，1987年获得山羊。子宫颈移入法以导管通过子宫颈移入子宫角顶端。无卵裂现象（未受精

8、）和异常卵（外膜破裂、卵裂球破裂等）都不能用于移植。将获能的精子和成熟的卵子置于受精液中共同培养，除钙离子载体诱导获能外，精子和卵子一般在获能液中完成受精过程。出现发情行为和生殖生理变化持续的出现发情行为和生殖生理变化持续的时间为时间为发情期发情期。各种动物发情期的长短各有不同，如各种动物发情期的长短各有不同，如小小鼠鼠3 3小时，小时，牛牛12122222小时，小时，羊羊24243636小时，小时，猪猪2 23 3天，天，马马4 46 6天，天，狗狗9 9天。天。动物的两次发情期之间，所处的时期为动物的两次发情期之间，所处的时期为休止期休止期。发情期和休止期有规律的交替出现，这发情期和休止期

9、有规律的交替出现，这种周期性的变化称为种周期性的变化称为发情周期发情周期。同期发情的意义1有利于推广人工授精。如果能在短时间内使畜群集中发情，就可以根据预定的日程巡回进行定期配种。2便于组织生产。可使母牛配种妊娠、分娩及犊牛的培育在时间上相对集中，便于肉牛的成批生产，从而有效地进行饲养管理，节约劳动力和费用，适合工厂化养牛。3提高繁殖率。能使乏情状态的母牛出现性周期活动。4在胚胎移植中，是必不可少的方法。（3）超数排卵）超数排卵 对供体母畜，都要求实现超数排卵，才对供体母畜，都要求实现超数排卵，才能最大限度地提高其利用率。能最大限度地提高其利用率。诱导家畜超数排卵，都需注射外源激素，诱导家畜超

10、数排卵，都需注射外源激素，其目的就是人工的使动物的激素水平达到阈其目的就是人工的使动物的激素水平达到阈值，从而诱发卵的成熟与排放。对卵巢产生值，从而诱发卵的成熟与排放。对卵巢产生作用并能引起卵的成熟和排卵的激素主要有作用并能引起卵的成熟和排卵的激素主要有孕酮、雌二醇（孕酮、雌二醇（E2）、促卵泡激素（）、促卵泡激素（FSH）、）、促黄体激素（促黄体激素（LH）、促性腺激素释放激素）、促性腺激素释放激素（GnRH）等。）等。2胚胎的采集胚胎的采集 以发情日为第以发情日为第0天，在天，在67.5天或天或第第23天分别从子宫角或输卵管回收天分别从子宫角或输卵管回收胚胎。胚胎。采胚就是借助工具利用冲胚

11、液将采胚就是借助工具利用冲胚液将胚胎从生殖道中冲出并收集在器皿中。胚胎从生殖道中冲出并收集在器皿中。胚胎的采集方法有如下几种胚胎的采集方法有如下几种（1）外科手术回收法）外科手术回收法 剖腹，根据间隔时间确定部位，剖腹，根据间隔时间确定部位，注入冲卵液回收受精卵。注入冲卵液回收受精卵。优点此法操作简便，冲卵液用量少，优点此法操作简便，冲卵液用量少，容易检卵，回收率高。容易检卵，回收率高。缺点是需全身麻醉，剖腹后会形缺点是需全身麻醉，剖腹后会形成组织粘连和瘢痕，术前需空腹。成组织粘连和瘢痕，术前需空腹。牛胚胎阻断发生在816细胞阶段，这就导致体外受精卵的囊胚发育率远低于体内受精。用体细胞与胚胎在

12、微滴同培养，利用体细胞生长过程中分泌的有益因子，促进胚胎发育，克服发育阻断。由于手术法采胚在生产实践中受到限制，目前在牛等大家畜中都用采胚管进行非手术法采胚。主要适用于分割体积较大的胚胎，其优势在于可以不用显微操作仪。（2）产犊率低，胎儿初生重高。此法采卵率可达50%左右（根据卵巢中黄体数计算），操作技术好可达60%70%，基本达到手术法的回收率，而且母畜受伤害较小，可重复多次采卵，方便简单。人工受精与体外受精的主要区别？2010年诺贝尔生理学、医学奖体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。（3）超数排卵 对供体母畜，都要求实现超数排卵，才能最大限度地提高其

13、利用率。1984年Takeda一步法冷冻小鼠胚胎；1985年Rall和Fahy用DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇组成玻璃化溶液，进行一步冻存，获得87.第一节 胚胎移植技术A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀；2胚胎的采集 以发情日为第0天，在67.一、胚胎分割的理论依据有的动物一年出现多次发情周期，则发情期较短，一年生产数次，每次产仔56个，如鼠类。到晚桑椹胚时，胚胎发生初步分化，这时进行胚胎分割，可以重新发育到囊胚。胚胎保存的方法可以分为非冷冻保存和冷冻保存。经检查后完整的胚胎即可移植到受体子经检查后完整的胚胎即可移植到受体子宫内。移植必须在同一部位或相似部位，整宫内。

14、移植必须在同一部位或相似部位，整个过程必须迅速准确，保持无菌操作。个过程必须迅速准确，保持无菌操作。（1）手术移植）手术移植 腹部手术法剖腹，拉出子宫角，将胚胎移腹部手术法剖腹，拉出子宫角，将胚胎移植相应发育部位。手术移植法移卵容易，损植相应发育部位。手术移植法移卵容易，损伤小。伤小。第二节第二节 胚胎保存技术胚胎保存技术 由一枚胚胎通过胚胎分割方式获得的后代数量有限。第三节 胚胎分割技术屠宰后卵巢上采集:这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、保温（30-37)后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求3-10mm）也可对卵巢进行

15、切片，收集卵母细胞。2胚胎移植的意义（1）发挥优良母畜的繁殖潜力（2）促进家畜改良的速度（3）作为胚胎操作的基础（4）保存遗传资源人工受精与体外受精的主要区别？胚胎保存的方法可以分为非冷冻保存和冷冻保存。体外受精是指通过人为操作成熟的卵子与精子在合适的体外环境中完成受精过程。由一枚胚胎通过胚胎分割方式获得的后代数量有限。子宫颈迂回法通过阴道穿刺，借助插入直肠的手，用月针形导管将胚胎移入子宫角。（2）缩短世代间隔、增加选择强度，促进家畜改良速度；（2）产犊率低，胎儿初生重高。（4）是胚胎分割、胚胎嵌合、性别鉴定和核移植等其它胚胎生物技术的基础，也是基础生命科学研究的重要手段。由于手术法采胚在生产

16、实践中受到限制，目前在牛等大家畜中都用采胚管进行非手术法采胚。一、胚胎移植的发展历史与意义1890年，剑桥大学的Walter Heape首次提出 了受精卵可以在宿主母体内发育的可能。经检查后完整的胚胎即可移植到受体子宫内。2004年，26岁的路易斯与34岁的韦斯利姆林德喜结连理。兽医学选择排除病畜，尤其生殖器官病患。大多数哺乳动物早期胚胎去掉一半，剩余的部分仍发育成完整的胚胎。二、胚胎移植的操作流程1同期发情和超数排卵（1）供体、受体的选择畜牧学选择胚胎移植的供体要求是加快繁殖的生产能力较高的优良品种，受体则是繁殖性能较高的本地品种。1942年，Nicholas证明2细胞兔胚单个卵球可发育成胚

17、胎的能力。胚胎移植流程图胚胎移植流程图第三节第三节 胚胎分割技术胚胎分割技术 （1）显微针分割法）显微针分割法 第四节第四节 体外受精技术体外受精技术 1890年，剑桥大学的Walter Heape首次提出 了受精卵可以在宿主母体内发育的可能。（3）胚胎质量鉴定 正常发育的胚胎，其中细胞（卵裂球）外形整齐、大小一致、分布均匀、外膜完整。最后还存在同卵多胎的局限性。20世纪60年代初至20世纪80年代中期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。由于手术法采胚在生产实践中受到限制，目前在牛等大家畜中都用采胚管进行非手术法采胚。屠宰后卵巢上

18、采集:这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、保温（30-37)后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求3-10mm）也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。同期发情的意义诱导家畜超数排卵，都需注射外源激素，其目的就是人工的使动物的激素水平达到阈值，从而诱发卵的成熟与排放。人工受精与体外受精的主要区别？1951年：美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展。1970年Mullen将2细胞胚分割，首次获得小鼠同卵双生后代。D级是死亡或退化的卵母细胞。1890年，剑桥大学的Walt

19、er Heape首次提出 了受精卵可以在宿主母体内发育的可能。屠宰后卵巢上采集:这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、保温（30-37)后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求3-10mm）也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体,要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。腹部手术法剖腹，拉出子宫角，将胚胎移植相应发育部位。路易斯的出生再次引起了社会对“试管婴儿”的关注，很多人对“试管婴儿”的健康提出质疑，“他们的发育正常么？”“智力会不会有问题？”“这项技术是

20、否值得推广？”而更多的压力来自伦理和社会方面，为了提高成功率，会培育多个胚胎，那么其他未被采用的胚胎又该如何对待？这种工厂化的生产方式是否会加速人口过剩？人类的后代是否可以改造？人类基因组是否也能被设计？（1）卵母细胞的采集 精子采集精子采集 超数排卵超数排卵 假孕动物准备假孕动物准备 精子获能精子获能 卵子采集卵子采集 胚胎移植胚胎移植 体外受精体外受精 胚胎培养胚胎培养 产仔产仔代高代高34kg34kg，导致受体母畜难产率高。，导致受体母畜难产率高。(2)(2)加强腔前卵泡培养的研究，利用优良母加强腔前卵泡培养的研究，利用优良母畜的遗传资源畜的遗传资源 目前胚胎移植技术利用的卵母细胞不足目

21、前胚胎移植技术利用的卵母细胞不足家畜卵巢上卵母细胞总数的千分之一。为家畜卵巢上卵母细胞总数的千分之一。为此，一方面提高活体取卵技术，另一方面此，一方面提高活体取卵技术，另一方面需研究腔前卵泡和小卵泡的体外成熟技术。需研究腔前卵泡和小卵泡的体外成熟技术。为保证卵母细胞的稳定来源及良种母畜或为保证卵母细胞的稳定来源及良种母畜或濒危动物的保种，卵泡和卵母细胞的超低濒危动物的保种，卵泡和卵母细胞的超低温冷冻保存技术的研究也必须加强。温冷冻保存技术的研究也必须加强。无卵裂现象（未受精）和异常卵（外膜破裂、卵裂球破裂等）都不能用于移植。2004年，26岁的路易斯与34岁的韦斯利姆林德喜结连理。5%的链霉蛋

22、白酶去掉胚胎透明带，然后用显微玻璃针或微手术刀将裸胚一分为二。人们发现胚胎分割后，同卵双生犊牛的毛色和斑纹并不完全相同，而在2细胞阶段分割，却表现出遗传一致性。在立体显微镜下，用直径略小于胚胎的毛细管吹吸胚胎从透明带中脱出。由他开创的体外受精技术使400多万人得以降生。采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体,要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。1985年Rall和Fahy用DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇组成玻璃化溶液，进行一步冻存，获得87.为克隆技术提供成熟卵母细胞和克隆胚胎的培养体系；由于手术法采胚在生产实践中受到限制，目前在牛等大家畜中都用采

23、胚管进行非手术法采胚。1878年：德国人Scnenk以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术，但一直没有获得成功。有的一年任何时期都可以发情，没有明显的生殖季节。1890年，剑桥大学的Walter Heape首次提出 了受精卵可以在宿主母体内发育的可能。此法采卵率可达50%左右（根据卵巢中黄体数计算），操作技术好可达60%70%，基本达到手术法的回收率，而且母畜受伤害较小，可重复多次采卵，方便简单。由于手术法采胚在生产实践中受到限制，目前在牛等大家畜中都用采胚管进行非手术法采胚。剖腹，根据间隔时间确定部位，注入冲卵液回收受精卵。2、精子的采集与体外获能由超数排卵采集的卵母细胞已在体内

24、发育成熟，不需培养可直接与精子受精，对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。非冷冻保存主要有三种方法，即异种动物体内保存法、卵和胚胎的37保存法和冷藏保存法。2010年诺贝尔生理学、医学奖1984年Takeda一步法冷冻小鼠胚胎；(3)(3)加强体外受精与其他生物技术的结合加强体外受精与其他生物技术的结合 体外受精与转基因、克隆、性别控制及胚胎体外受精与转基因、克隆、性别控制及胚胎干细胞的培养密不可分。通过体外受精可为外源干细胞的培养密不可分。通过体外受精可为外源基因的导入提供充足的胚胎来源；为克隆技术提基因的导入提供充足的胚胎来源；为克隆技术提供成熟卵母细胞和克隆胚胎的培养体系；用分离供成熟卵母

25、细胞和克隆胚胎的培养体系；用分离的的X X和和Y Y精子与卵子体外受精，可对哺乳动物进行精子与卵子体外受精，可对哺乳动物进行性别控制。胚胎干细胞的分离也需要胚胎移植技性别控制。胚胎干细胞的分离也需要胚胎移植技术提供胚胎和培养体系。这些生物技术的综合发术提供胚胎和培养体系。这些生物技术的综合发展将对人类生活产生重大影响展将对人类生活产生重大影响.2010年年10月月4日公布的诺贝尔日公布的诺贝尔生理学或医学奖，获奖者为素有生理学或医学奖，获奖者为素有“试管婴儿之父试管婴儿之父”之称的英国生理之称的英国生理学家罗伯特学家罗伯特爱德华兹。由他开创的爱德华兹。由他开创的体外受精技术使体外受精技术使40

26、0多万人得以降多万人得以降生。生。英国科学家英国科学家罗伯特罗伯特爱德华兹爱德华兹 试管婴儿之父试管婴儿之父2010年诺贝尔生理学、年诺贝尔生理学、医学奖医学奖 1978年年7月月25日日11时时47分，世界第一位分，世界第一位“试试管婴儿管婴儿”诞生了，名为路易丝诞生了，名为路易丝布朗。布朗。路易斯的出生再次引起了社会对路易斯的出生再次引起了社会对“试管婴儿试管婴儿”的关注，很多人对的关注，很多人对“试管婴儿试管婴儿”的健康提出质疑，的健康提出质疑，“他们的发育正常么？他们的发育正常么？”“”“智力会不会有问智力会不会有问题？题？”“”“这项技术是否值得推广？这项技术是否值得推广？”而更多的

27、压而更多的压力来自伦理和社会方面，为了提高成功率，会培力来自伦理和社会方面，为了提高成功率，会培育多个胚胎，那么其他未被采用的胚胎又该如何育多个胚胎，那么其他未被采用的胚胎又该如何对待？这种工厂化的生产方式是否会加速人口过对待？这种工厂化的生产方式是否会加速人口过剩？人类的后代是否可以改造？人类基因组是否剩？人类的后代是否可以改造？人类基因组是否也能被设计？也能被设计？1970年Mullen将2细胞胚分割，首次获得小鼠同卵双生后代。最后还存在同卵多胎的局限性。2胚胎的采集 以发情日为第0天，在67.一般只培养A级和B级卵母细胞。1986年我国张涌利用胚胎分割获得小鼠后代，1987年获得山羊。第

28、一节 胚胎移植技术5%的链霉蛋白酶去掉胚胎透明带，然后用显微玻璃针或微手术刀将裸胚一分为二。由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不需培养可直接与精子受精，对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。用0.各种动物发情期的长短各有不同，如小鼠3小时，牛1222小时，羊2436小时，猪23天，马46天，狗9天。无卵裂现象（未受精）和异常卵（外膜破裂、卵裂球破裂等）都不能用于移植。优点此法操作简便，冲卵液用量少，容易检卵，回收率高。20世纪60年代初至20世纪80年代中期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。1951年：美籍华人张明觉和澳大

29、利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展。分割方法有显微操作仪分割法和徒手分割法。1984年Takeda一步法冷冻小鼠胚胎；目前胚胎移植技术利用的卵母细胞不足家畜卵巢上卵母细胞总数的千分之一。哺乳动物精子的获能方法有培养和化学诱导两种方法。不过，路易丝不是世界首名“试管婴儿妈妈”。2004年，年，26岁的路易斯与岁的路易斯与34岁的韦斯岁的韦斯利利姆林德喜结连理。爱德华兹受邀参加姆林德喜结连理。爱德华兹受邀参加他们的婚礼。他们的婚礼。2006年年初，路易丝以自年年初，路易丝以自然受孕方式怀孕，当年然受孕方式怀孕，当年12月月20日自然分日自然分娩产下男婴卡梅伦。不过，路易丝不是世娩产下男婴卡梅伦。不过，路易丝不是世界首名界首名“试管婴儿妈妈试管婴儿妈妈”。她的妹妹纳塔。她的妹妹纳塔莉莉1999年自然分娩产下一个孩子，如今年自然分娩产下一个孩子，如今育有两个孩子。育有两个孩子。